桑黄菌中(3R,8aS)-六氢-3-甲基吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离技术

摘要

本发明公开了一种桑黄菌（火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus(Berk et Curt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(Allesch et Schnabl)Imaz）（3R，8aS）-六氢-3-甲基吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇梯度洗脱，再次正相硅胶层析，接下来是HPLC检测，然后进行常压反相制备，再次进行HPLC检测，最后1D-HNMR检测，即得（3R，8aS）-六氢-3-甲基吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

主权项

桑黄菌中(3R,8aS)‑六氢‑3‑甲基吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮的分离方法，其步骤顺序如下：(1)制备桑黄粗提物；(2)将上述步骤(1)所得的桑黄粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2～5次；(3)收集上述步骤(2)中最后一次的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；(4)将步骤(3)得到的产物进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；(5)使用HPLC检测，HPLC检测条件为0min：100％水，10min：100％甲醇，收集步骤(4)的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；(6)将步骤(5)得到的产物进行常压反相层析，洗脱剂为甲醇与水；(7)HPLC检测，HPLC检测条件为0min：100％水，10min：100％甲醇，减压干燥，即为(3R,8aS)‑六氢‑3‑甲基吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮；其中所述桑黄粗提物，由下述方法制得：(a)发酵培养基配方以克/100毫升计是：玉米淀粉  1～5％      葡萄糖      1～5％蛋白胨    0.1～0.5％  酵母膏      0.1～0.5％硫酸镁    0.1～0.5％  磷酸二氢钾  0.01～0.05％(b)所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；(c)取步骤(b)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；(d)用体积百分比为60～95％的乙醇对上述步骤(c)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90％；(e)对步骤(d)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；(f)将步骤(e)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。