一种土壤漆酶活性的荧光测定方法

摘要

本发明属于土壤化学分析技术领域，具体涉及一种土壤漆酶活性的荧光测定方法。利用漆酶直接催化氧化Amplex Red形成强荧光物质试卤灵，建立一种荧光方法测定漆酶活性，并应用于土壤漆酶活性测定。本发明步骤为：以ABTS为底物测出漆酶酶活，然后制作漆酶催化氧化Amplex Red的工作曲线，对土壤漆酶活性进行测定。本发明的优点在于，漆酶催化氧化Amplex Red无需添加除溶解氧以外的氧化剂，且可直接用于土壤混浊液中漆酶活性测定，本发明克服了传统方法测定土壤漆酶活性偏低以及漆酶提取过程复杂的缺点，以此建立的荧光方法测定漆酶活性具有较低检测限和较宽检测范围。

主权项

一种土壤漆酶活性的荧光测定方法，其特征在于，包括下列步骤：利用分光光度法，以2,2‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)二铵盐即ABTS为底物，制作漆酶催化氧化Amplex Red(10‑乙酰基‑3,7‑二羟基苯噁嗪，简称AR)的工作曲线，对土壤漆酶活性进行检测，具体步骤如下：(1)配制pH4.4的Na₂HPO₄‑柠檬酸缓冲溶液，5.0mmol/L的2,2‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)二铵盐)即ABTS溶液，在避光条件下放置，另配10.0mg/mL的漆酶溶液；(2)以步骤(1)的Na₂HPO₄‑柠檬酸缓冲液为缓冲体系，终浓度为0.5mmol/L ABTS，5.0μg/mL漆酶为反应体系，测定4min反应时间内OD₄₂₀的变化，每间隔1min测定一次，共读数5次；根据4min内OD₄₂₀的变化值，得出漆酶酶活，酶活定义以每min催化1μmol底物转化为产物的酶量为标准；(3)配制pH6.4的Na₂HPO₄‑NaH₂PO₄缓冲液，将5.0mg(10‑乙酰基‑3,7‑二羟基苯噁嗪)即AR以1944μL的二甲基亚砜(DMSO)溶解得10.0mmol/L AR，分装后于‑20℃保存备用，使用时用超纯水和DMSO稀释至10‑500μmol/L，并使DMSO在AR溶液中体积分数为5％；(4)以步骤(3)中pH6.4的Na₂HPO₄‑NaH₂PO₄缓冲液为缓冲体系，以终浓度分别为1.0‑50.0μmol/L的AR，0.5％DMSO，5.62‑702U/L漆酶为反应体系，分别制作出1.0‑50μmol/L底物浓度下漆酶催化氧化AR的工作曲线，以3倍性噪比测出每个AR浓度下的最低检测限，并以最低检测限初始达到最低时的AR浓度下的工作曲线作为最终工作曲线；(5)以步骤(3)中pH6.4的Na₂HPO₄‑NaH₂PO₄缓冲液为缓冲体系，终浓度5.0mg/mL土壤溶液，8.0μmol/L AR为反应体系，检测由土壤漆酶催化AR形成试卤灵产生的荧光信号值F，并代入工作曲线方程F＝0.1434U+0.0151，得出相应的漆酶活性U。