新的综合性耳聋相关基因突变检测体系及试剂盒

摘要

本发明公开了一种新的综合性耳聋相关基因突变检测体系，针对目前已知的6个与Waardenburg综合征相关的基因，选取的59个检测位点组成耳聋基因突变检测体系，采用连接酶连接反应的高特异性对目的区域进行杂交、连接，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增。本发明的优越性在于通过对现有多重核酸分子扩增技术加以改进，设计特定的检测探针，设置特定的检测体系组分和反应条件，以同时对6个已知与Waardenburg综合征有关的基因上的共59个位点进行快速拷贝数变异检测，检测可在一个工作日内完成，最低仅需200纳克的DNA即可得到准确的检测结果。

主权项

一种新的综合性耳聋相关基因突变检测体系，其特征在于，针对目前已知的6个与Waardenburg综合征相关的基因，选取的59个检测位点组成耳聋基因突变检测体系，采用连接酶连接反应的高特异性对目的区域进行杂交、连接，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对电泳图谱的分析获取各个位点的峰高，其中：1)共设计了91对多重PCR引物，91对引物中包括59对检测探针和32对参照探针；针对每个位点设计2条探针：1条5'端探针和1条3'端探针，其5'端探针序列由荧光集团，正向通用引物序列和位点5’侧特异性序列组成，3'端探针序列由位点3’侧特异性序列、位点鉴别连接序列、3'端通用引物序列组成；所述的5'端探针序列如SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:91所示，所述的3'端探针序列如SEQ ID NO.:92至SEQ ID NO.:182所示；2)将高温处理后的短片段基因组DNA与探针混合物变性复性，各探针与对应模板进行配对；3)加入连接酶反应体系，配对在同一模板上的紧邻探针在连接酶作用下进行特异性连接，产生连接产物；4)利用带荧光标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增，不同长度的扩增产物利用荧光毛细管电泳获得分离；5)通过对荧光毛细管电泳数据文件中不同长度的连接产物峰谱的分析确定不同位点的峰高；6)多重位点分型的实现：通过改变位点鉴别序连接序列的长度来获取不同连接长度的连接产物，实现多个位点的检测；通过改变探针中通用引物序列，随后采用不同荧光标记的通用PCR引物进行扩增从而进一步增加检测位点的数目，所述通用PCR引物序列如SEQ ID NO.:183至SEQ ID NO.:188所示。