主权项 |
一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法,其特征在于:操作步聚如下:①制备低渗液:向每100毫升蒸馏水中放入735毫克柠檬酸钠和1350毫克果糖制成低渗液,并使其离子强度为0.15(系数),渗透压150摩斯摩尔的溶液;②向每1毫升 步骤①中所述的低渗液中加入0.1毫升精液,混匀,在水温为37℃的水中水浴30分钟后得低渗处理后精液,观察200个精子,计算尾部肿胀的精子比率;③取1毫升步骤②中所述的低渗处理后精液,以1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟,静置分层后,弃上清液,所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释到精子密度1000万个/毫升,得稀释精液;④取步骤③中所述的稀释精液0.2毫升与琼脂凝胶按体积比1:1比例混匀,放置在1.5毫升的离心管内,在室温37℃条件下孵育5分钟得配置精液;⑤吸取步骤④中所述的配置精液50微升置入载玻片上,加盖盖玻片,在环境温度4℃的条件下放置4分钟;所述载玻片是表面铺有一层薄薄的多聚赖氨酸的载玻片;⑥将步骤⑤所述的载玻片上的盖玻片去除,将载玻片浸泡在茯苓多糖液中25分钟,以对载玻片上物质作固定处理;茯苓多糖液是由每10毫升生理盐水中加入1克茯苓多糖配置而成;⑦用磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗步骤⑥所述固定后的载玻片二次,每次5分钟;然后将浸洗后载玻片在10毫升0.2%的Triton X‑100中浸洗处理5分钟,之后再用磷酸盐缓冲液浸洗二次,每次5分钟;⑧用50微升 TdT和450微升 荧光素标记的dUTP液混匀制备混合液;将经步骤⑦处理后的数块载玻片分成阴性对照组和阳性对照组,其中向阴性对照组的每块载玻片加50微升 荧光素标记的dUTP液;阳性对照组的每块载玻片先加入100微升 DNase 1,反应在15~25℃×10分钟,之后将每块载玻片在0.2%的Triton X‑100中处理,10毫升中浸洗5分钟,再用PBS浸洗二次,每次5分钟;阴性对照组和阳性对照组的所有载玻片干后在暗湿盒中反应37℃×30分钟,PBS漂洗3次,每次5分钟; 暗湿盒是密闭避光、湿度在80%以上的盒子;⑨将步骤⑧最终处理后的所有载玻片加50~100微升二氨基联苯胺(DAB)底物,反应15~25℃×10分钟;⑩将步骤⑨处理后的载玻片用苏木素或甲基绿复染,5秒后立即用自来水冲洗;梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片;在显微镜下观察结果。 |