一种快速检测副溶血性弧菌的方法

摘要

本发明提供了一种快速检测副溶血性弧菌的检测方法。方案将Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球富集细菌，制备试纸条，上样检测。免去了将副溶血性弧菌从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将Ru(bqy)₃²⁺纳米微球喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。检测方案灵敏度非常高、稳定性很好。

主权项

一种快速检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤：1)纳米微球的制备：a.添加0.4‑0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2‑1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80‑120℃，然后将3‑7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe₃O₄纳米粒子；b.取12mg Fe₃O₄纳米粒子用1‑10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3‑0.9mL的NH₄OH溶液，再将10‑300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe₃O₄纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子；c.把10‑300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1‑10mL去离子水和1mL 0.5‑3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)₃²⁺)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子，最后加入600‑900μL的NH₄OH，剧烈搅拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，用去离子水清洗备用；d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球；e.将硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球添加到包含0.06g NaHCO₃，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球；2)取0.5‑2mg羧基化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至5‑10，加入0.05‑0.18mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及50‑300μg抗副溶血性弧菌单抗，在温度37℃时，放在10‑15rpm的旋转仪上偶联60‑120min，磁分离3‑5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3‑5遍之后，取1mL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5‑1h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球‑单抗；所述偶联缓冲液配制方法如下：将3mL 19.07g/mL的硼砂与7mL 12.37 g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；所述清洗缓冲液配制方法如下：称取0.43g 2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5‑6.0；所述封闭剂配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；3)培养副溶血性弧菌，将菌液调整浓度为10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL，各取1mL备用；取待测样品溶液1mL、各浓度菌液1mL，分别与100‑150μg Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球‑单抗，于温度37℃，旋转仪转速10‑15rpm混合孵育30‑60min，孵育后磁分离3‑5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球‑单抗‑菌；4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用pH 8.50.1M Tris‑HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween‑20)浸泡处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出备用；将副溶血性弧菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为1‑2mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡；将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；5)试纸条对样品的检测：将收集到的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球‑单抗‑菌稀释到50‑150μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10‑15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；6)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有副溶血性弧菌，T线不显色则说明样品中没有副溶血性弧菌或是含有副溶血性弧菌的量低于10³CFU/mL；7)定量分析：使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的副溶血性弧菌数量。