一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法及表达载体

摘要

本发明提供了一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法，包括以下步骤：1、pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体的构建。2、重组蛋白的诱导表达：将构建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重组质粒和pGEX-6P1载体转化BL21表达菌株，涂Amp⁺平板后于恒温培养箱内倒置过夜，挑取单克隆菌落接种于含Amp⁺的液体LB培养基中，于摇床中振荡培养作为种子液，将种子液接种至含Amp⁺的液体LB培养基中，继续用摇床振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，保存菌液后加入IPTG，振荡培养诱导蛋白的表达。该方法能从上清中表达出大量可溶性的OsSSI2蛋白，最终提高了目的蛋白的可溶性表达。

主权项

一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、pGEX‑6P1‑OsSSI2原核表达载体的构建：以OsSSI2质粒DNA为PCR扩增模板，限制性内切酶BamH I、EcoR I为酶切位点设计引物，引物为：OsSSI26P‑1‑BamH IF：5’—GATAGGATCCGCGTCGAGGATGGCGCTCC—3’；OsSSI26P‑1‑EcoR IR：5’—GCGAGAATTCGAGTTGAACTTCCCTACC—3’；利用PCR反应扩增出目的片段，扩增反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测；再使用清洁回收试剂盒对目的片段进行清洁回收，然后用限制性内切酶BamH I和EcoR I同时双酶切目的片段和pGEX‑6P1空载体；使用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段及载体片段进行切胶回收，用Ligation high连接酶连接OsSSI2目的片段和pGEX‑6P1载体片段，然后转化DH5α感受态细胞，涂Amp⁺平板后于恒温培养箱内倒置过夜培养；从平板上随机挑取单克隆，提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的单克隆进行测序，其测序结果100％匹配，说明pGEX‑6P1‑OsSSI2原核表达载体构建成功；(2)、重组蛋白的诱导表达：将构建好的pGEX‑6P1‑OsSSI2的重组质粒和pGEX‑6P1载体转化BL21表达菌株，涂Amp⁺平板后于恒温培养箱内倒置过夜，挑取单克隆菌落接种于含Amp⁺的液体LB培养基中，于摇床中振荡培养作为种子液，将种子液接种至含Amp⁺的液体LB培养基中，继续用摇床振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，保存菌液后加入IPTG，振荡培养诱导蛋白的表达。