一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒

摘要

本发明涉及动物疫病诊断技术领域，更具体的讲是一种用于检测羊的伪狂犬病毒抗体ELISA试剂盒，本发明提供的ELISA试剂盒包括包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶标结合物、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶、自封袋、使用说明书，所述的试剂盒能快速、灵敏、准确的检测羊体内的PRV抗体水平，填补了国内外该领域的空白。所述的试剂盒用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，用以实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的羊体内PRV抗体的检测。

主权项

一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括以下组分：包被板、阳性对照、阴性对照、酶标结合物、样品稀释液、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶；所述酶标结合物是由酶标抗体稀释液稀释2000倍的HRP标记的兔抗山羊IgG；所述酶标抗体稀释液为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，甘油 20ml，小牛血清 200ml， 酪蛋白5g，蔗糖 2g， Triton X‑100 10ml，硫柳汞 0.1g，加纯水定容至1L；所述样品稀释液包括NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，吐温‑20 5ml，甘油 10ml，小牛血清 100ml，硫柳汞 0.1g，加纯水定容至1L；所述包被板由伪狂犬病毒的重组gD蛋白作为包被抗原，并由封闭液封闭，所述封闭液为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，小牛血清 100ml，蔗糖 50g，明胶 1g，酪蛋白 2.5g，硫柳汞 0.1g，加纯水定容至1L；所述重组gD蛋白的表达和纯化包括如下步骤： 1）根据GenBank公布的登录号为AY196984的PRV Fa株的gD基因序列，设计引物序列如下： P1：5’‑GGGGAATTCTACCCGTACAC‑3’ P2：5’‑GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA‑3’ 2）通过PCR扩增PRV Fa株gD基因，与pMD18‑T克隆载体连接； 3）双酶切重组质粒pMD18‑T‑gD，构建重组表达载体PET‑32a‑gD； 4）重组表达载体PET‑32a‑gD转化感受态细胞BL21(DE3)，诱导表达，然后选用纯化设备，亲和柱进行亲和纯化；所述20×浓缩洗涤液为NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，吐温‑20 5ml，加纯水定容至500ml；所述终止液为1M H₂SO₄，所述底物液为可溶型单组分TMB底物液；所述试剂盒还包括自封袋和使用说明书；上述的一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒的主要使用方法如下： （1）在A1和A2孔中分别加入100 μl阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100 μl阳性对照； （2）取100 μl经1：40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37 ℃孵育1h； （3）将各孔的液体弃入废液桶，每孔加250μl的洗涤液进行洗板，重复5次，每次30s； （4）每孔加100μl酶标结合物；37 ℃孵育1h； （5）重复步骤（3）； （6）每孔加100 μl底物液； （7）37℃避光显色孵育10min； （8）每孔加100 μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450nm值； （9）临界值（C.O.）的计算 正常情况下，阳性对照孔OD450值≥0.4；阴性对照孔OD450值≤0.2；临界值=0.17+阴性对照孔均值；阴性对照孔OD450值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔OD450值都大于0.2时须重复实验；阴性对照孔低于0.05时以0.05计算； （10）结果判定 检测样品OD450值≥临界值，判定该检测样品为阳性；检测样品OD450值＜临界值，判定该检测样品为阴性。