一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及应用

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及应用；具体涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及其在放疗、化疗后辅助治疗的应用。本发明所述制备方法简单、快捷，适于产业化生产；此外，本发明的药效学研究，结果表明，所述酪氨酰tRNA合成酶突变体可用于治疗肿瘤放、化疗诱导的血小板减少症。

主权项

一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)工程菌复苏和接种工程菌复苏及摇瓶接种：取出原始祖种子菌，100级洁净度条件下，在LBK平板上接种，37℃培养2‑3天；100级洁净度条件下，从平板上挑取单克隆菌落，接种于20ml含kanamycin LB培养液中，kanamycin浓度为50μg/ml，30℃振摇培养8小时，至OD₆₀₀为2，制得一级种子液；将上述一级种子液加入到300ml含kanamycin LB培液中，30℃振摇培养6小时，至OD₆₀₀为2，制得二级种子液；(2)发酵罐设定及培养基准备清洗发酵罐，安装好各个管道，按校正程序进行pH校正，加入S1培养基，其由Na₂HPO₄ 6g/L、KH₂PO₄ 35g/L、NaCl 2.93g/L组成，121℃1.5kg/cm²高压灭菌20min，冷却至室温；溶氧电极校正和设定各种参数，发酵罐温度设定为30℃；无菌条件下，向发酵罐中加入S2，S3，S4，S5培养基，其中，S2培养基由NH₄Cl 0.4g/L、Vitamin B 10.88mg/L组成，S3培养基，其内容物为MgSO₄ 1.2g/L，S4培养基，其内容物为CA 10g/L，S5培养基，其由Glucose 10g/L、CaCl₂ 11.13mg/L组成；(3)二级种子液接种培养及IPTG诱导酪氨酰tRNA合成酶突变体表达在无菌条件下，将所述二级种子液接种入发酵罐内的培养基中，通入空气，进行扩增培养；每隔1h取样5ml，测定OD₆₀₀；控制溶氧50％±10％，观察pH、温度、搅拌转速；pH以氨水调节，随时流加适量消泡剂；至OD₆₀₀达到30，加入IPTG诱导6小时，停止发酵，4000rpm×20min离心，收集菌体；工程菌在发酵罐内生长至OD₆₀₀30，加入IPTG，终浓度为0.5Mol/L，诱导目的蛋白表达，诱导6小时后，表达量占全菌总蛋白的50％，每升培液收获湿菌100g；(4)酪氨酰tRNA合成酶突变体的纯化①高压破菌菌体用醋酸缓冲液以1:10w/v重悬，将混悬液倒入均质机，300bar压力下，完成均质，1000bar压力下，完成破菌；10,000rpm×30min离心，分离上清；②阳离子交换层析，洁净度10000级，4℃；层析柱规格为12.5cm×40cm，填料为SP‑Sepharose Fast Flow，纯化使用AKTA Explore系统完成，用NaAc‑HAc平衡，将上述分离得到的上清上样，流速15ml/min；用NaAc‑HAc冲洗至OD₂₈₀达到基线，流速15ml/min，用NaAc‑HAc‑NaCl线性梯度洗脱，流速15ml/min，监测OD₂₈₀，收集活性组份；③凝胶过滤层析，洁净度10000级，4℃；层析柱规格为12.5cm×100cm，填料为SephadexG‑50，纯化使用AKTA Explore系统完成，用0.02Mol/L PB平衡，将经过阳离子交换层析收集的样品自动进样，用0.02Mol/L PB洗脱，流速10ml/min，监测OD280，收集活性组份；④阴离子交换层析，洁净度10000级，4℃层析柱规格为2.6cm×10cm，填料为Q‑sepharose Fast Flow，纯化使用AKTA Explore系统完成，用0.02Mol/L PB平衡，经凝胶过滤层析收集的组份上样，流速15ml/min，收集上样峰组分；1次5L规模的发酵，收集菌体100g，经3步纯化，获得纯度＞95％的酪氨酰tRNA合成酶突变体蛋白350mg。