一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法

摘要

本发明适用于生物技术领域，尤其涉及一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法，包括：克隆第一序列(SEQ ID NO:5)和第二序列(SEQ ID NO:6)；获得kansacB基因作为第三序列；将它们连接成第一组合序列；将第一组合序列插入至质粒pMAK705，获得第一敲除质粒；转化该第一敲除质粒，获得第一次双交换大肠杆菌；将第一序列和第二序列连接成第二组合序列，将其插入至质粒pMAK705，构成第二敲除质粒；将该第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌中，获得目的大肠杆菌。本发明的制备方法操作简便，且未引入任何多余的序列，避免基因敲除后在染色体上留下残留痕迹，有利于菌株的基因组的稳定，且更方面于后续的改造工作。

主权项

一种ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，包括以下步骤：分别以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，克隆包括ClpP基因5’端表达序列及其上游序列的第一序列和包括ClpP基因3’端表达序列及其下游序列的第二序列：其中用第一引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2克隆所述第一序列，用第二引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4克隆所述第二序列；以质粒PUC‑KS为模板，获得第三序列，所述第三序列为kansacB基因，其中kan基因为卡那霉素抗性基因，sacB基因为蔗糖果聚糖酶基因；按照第一序列、第三序列及第二序列的顺序将所述第一序列、第三序列及第二序列连接成一段序列得第一组合序列，其中所述第一序列3’端与第三序列5’端连接，所述第三序列3’端与所述第二序列5’端连接；将所述第一组合序列插入至质粒pMAK705，获得第一敲除质粒；将所述第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得第一次双交换大肠杆菌；按照第一序列及第二序列的顺序将所述第一序列及第二序列连接成一段序列得第二组合序列，其中所述第一序列3’端与第二序列5’端连接；将所述第二组合序列插入至质粒pMAK705，构成第二敲除质粒；将所述第二敲除质粒转化至所述第一次双交换大肠杆菌中，获得目的重组大肠杆菌。