一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用

摘要

本发明公开了一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用，包括：原代培养仔猪口腔黏膜上皮细胞；提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT；真核表达质粒pCI-neo-hTERT转染细胞24h后给细胞换液，48h后加含500μg/mL G418的DMEM/F12培养基筛选；在高倍镜下标记阳性克隆，转入另外培养板培养；扩大培养；筛选1个月，培养基中不再添加G418，培养超过50代次的细胞即是永生化的细胞系，永生化的仔猪口腔黏膜上皮细胞原代细胞形态一致，均一。

主权项

一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法包括：原代培养猪口腔黏膜上皮细胞；提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI‑neo‑hTERT，采用脂质体转染法，将质粒导入原代培养的仔猪口腔黏膜上皮细胞；真核表达质粒pCI‑neo‑hTERT转染细胞24h后给细胞换液，48h后加含500μg/mL G418的DMEM/F12培养基筛选；高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，转入另外培养板培养；扩大培养：用含250μg/mL G418的培养基继续筛选培养一个月，得到抗G418稳转阳性细胞；筛选1个月后，培养基中不再添加G418，继续培养超过50代次的细胞即是永生化的细胞系，永生化的细胞呈现典型的铺路石状，与原代细胞形态一致。