LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法

摘要

本发明公开了一种基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法，包括稻瘟病菌菌丝样品的培养、过滤收集、液氮灭活处理、冷冻干燥；冻干后的菌丝块于-70℃冷藏作为样品备用。本发明还同时提供了利用上述样品进行的检测法，将样品研磨破碎后进行溶剂提取；提取完毕后，离心，所得上清过0.22μm的有机相微孔滤膜后进行上机检测：选用C18色谱柱（2.1×100mm，1.8μm）；进样量2μL；柱温60℃；流动相组成为含0.1%FA的水和含0.1%FA的乙腈，流速0.4mL/min；质谱采用ESI（+）电离方式，质量扫描范围100～1100。采用本发明的提取及检测方法能得到较好的TIC图。

主权项

一种基于LC‑MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法，其特征是：其中所述的基于LC‑MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备方法，包括稻瘟病菌菌丝样品的培养、过滤收集、液氮灭活处理、冷冻干燥；所述稻瘟病菌菌丝样品的培养为：将稻瘟病菌的菌丝组织于CM液体培养基中黑暗摇菌培养3～4d，培养温度为25.5～26.5℃，转速为100～200rpm；得菌丝培养物；所述过滤收集为：将菌丝培养物通过抽滤装置收集到干净的滤纸上并抽沥干；所述液氮灭活处理为：将附有菌丝的滤纸取出折成小纸包，投入到液氮中速冻3～5min；所述冷冻干燥为：将经灭活处理后的菌丝小包于‑35～‑45℃的低温下真空冷冻2～3天；从而确保菌丝组织的含水率≤3％；冻干后的菌丝块于‑70℃冷藏作为样品备用；对制备所得的样品进行检测的检测方法包括如下步骤：1)、研磨破碎：取冻干后的菌丝块进行研磨破碎处理，得菌丝粉末；2)、溶剂提取：在19.9～20.1mg的菌丝粉末中加入1.425～1.575mL的提取溶剂，还加入20μL作为内标的浓度为5mg/mL的伞形酮Umbelliferone溶液；采用超声提取的方式于24.5～25.5℃提取38～42min；所述提取溶剂为：在100体积份的体积浓度为75％甲醇中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；3)、提取完毕后，离心，所得上清过0.22μm的有机相微孔滤膜后进行下述步骤4)；4)、上机检测：选用2.1×100mm，1.8μm的C18色谱柱；进样量2μL；柱温60℃；流动相组成为含0.1％FA的水和含0.1％FA的乙腈，流速0.4mL/min；质谱采用ESI(+)电离方式，质量扫描范围100～1100；所述含0.1％FA的水为：在100体积份的水中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；所述含0.1％FA的乙腈为：在100体积份的乙腈中加入0.1体积份的甲酸混合后而得。