建立iPS的方法

摘要

本发明涉及一种建立iPS的方法，该方法包括如下步骤：利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法培养8天，将episomal的三个质粒用lonza的Human CD34+CellKit电转到单核细胞中，之后用vitrinectin处理的板子上培养，利用E6培养基培养12-15天后会看到克隆，20天左右将单克隆调到用vitrinectin处理的板子上用E8培养基培养，传代到10后鉴定。本发明建立在无插入的episomal技术上，无FBS，无feeder甚至是无动物源的iPS诱导和培养技术。

主权项

一种建立iPS的方法，其特征在于：包括如下步骤：利用ficoll分离外周血单核细胞，无血清红系培养方法培养8天；利用Amaxa细胞核转染仪进行细胞核转染，单个核细胞培养8天后，计数，1x10⁶细胞加入100μl配制好的电转缓冲液,包含不同组合质粒即5ug pEV SFFV‑OS+2.5ug pEV SFFV‑MK+2.5ug pEV SFFV‑B，混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U‑008转染程序进行电转；将电转后细胞种到预先vitronectin处理的6孔板的一个孔中，应用红系诱导培养基培养1天，加等量的hESC培养基E6+bFGF 100ng/ml培养1天后半数换液，只加hESC培养基E6+bFGF 100ng/ml，之后隔一天完全换成hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养液，并隔天换液；在挑单克隆之前在低氧培养条件下培养，所述的低氧培养条件为5％O₂、5％CO₂、90％N₂；并在培养基中加入0.25mM NaB提高重编程效率，第10天停止，第12‑15天开始可见克隆开始形成，第20天左右克隆逐渐成熟，通过机械传代方法，在显微镜下分离克隆，切成3,4块后吸出，转入hESC培养基E8培养系统，一周后用EDTA消化再传代，一直传10代，形成稳定的iPS细胞系；所述的红系培养方法所使用的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分：SCF终浓度100ng/ml,IL‑3终浓度10ng/ml,EPO终浓度2U/ml，IGF‑1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度1μM，转铁蛋白终浓度100μg/ml，其中Serum free medium(SFM)组成为：