一种兔瘟病毒抗体快速检测卡及其制备方法

摘要

本发明涉及一种兔瘟病毒抗体快速检测卡及其制备方法，具体步骤为：（1）抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的制备，包括免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化；（2）兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备，包括胶体金溶液的熬制、抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的标记、金标垫处理、样品垫处理、C,T线确定。本发明可以快速、灵敏、准确的检测兔瘟病毒抗体，克服了国内检测兔瘟抗体主要以红细胞血凝，酶联免疫检测的问题。

主权项

一种兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备方法，具体步骤为：（1）抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的制备①免疫程序将昆虫细胞表达蛋白VP60免疫原与501佐剂按体积比1:0.5‑1.5的比例混合，对8‑10周龄Balb/c小鼠进行免疫，腿部肌肉注射，50μg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上；5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍；②细胞融合将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20：0.5‑1.5的比例混合，800rpm离心5‑8min，弃去上清，于30S内加入1mL50%PEG（W/W），静置1min，在第一个1min内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基，在第二个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个1min内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个1min内缓慢加入10mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心10min，弃上清，用含20%小牛血清的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3‑6×10⁵个/mL铺于含2‑6×10⁴个/mL饲养细胞的细胞培养板，置于CO₂培养箱中； ③杂交瘤筛选及克隆化待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清检测，最终选取抗兔瘟病毒VP60杂交瘤细胞株2F4，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，所述的杂交瘤细胞株2F4于2015年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201582，保藏地址为中国武汉‑武汉大学；④ 抗体制备及纯化单克隆抗体的生产：采用动物体内腹水诱生法；单克隆抗体的纯化：采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得本发明抗兔瘟VP60单克隆抗体；（2）兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备①胶体金溶液的熬制采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；②抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的标记用 0.l mol/L的K₂CO₃调节胶体金pH值为9.0，每1 mL胶体金溶液加入6μg抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体，室温下120rpm摇30 min，加入10%牛血清白蛋白 20μL，室温下120rpm摇30 min，12000rpm离心20 min，弃上清，用0.01MPBS 溶解沉淀，即得到标记好的抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体； ③金标垫处理选择聚脂纤维6613作为金标结合垫，将金标垫浸泡在处理液A中5min，处理液A为0.01Mpbs，pH7.4，0.2%Triton X‑100，取出37℃烘干，备用；④样品垫处理选择DL42为样品垫，将样品垫浸泡在处理液B中5min，处理液B为 0.01 Mpbs，pH7.4，1%Triton X‑100，1%BSA，0.05% NaN₃）， 5min ,取出37℃烘干，备用；⑤ C,T线确定选择Sartorius Cn140膜，分别将兔瘟病毒VP60蛋白和羊抗鼠二抗作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1.3mg/mL和0.6mg/mL。