用于序列操纵的优化的CRISPR-CAS双切口酶系统、方法以及组合物

摘要

本发明提供了用于操纵靶序列的序列和/或活性的系统、方法、和组合物的递送、工程化和优化。提供了载体和载体系统、以及用于设计和使用此类载体的方法，其中这些载体和载体系统中的一些编码CRISPR复合物的一种或多种组分。还提供了在原核和真核细胞中引导CRISPR复合物形成以确保增强的靶标识别特异性并避免毒性的方法。

主权项

一种通过对在细胞中的感兴趣基因组座位中的DNA双链体的相对链上的第一靶序列和第二靶序列进行操纵而使脱靶修饰最小化来修饰生物或非人类生物的方法，该方法包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：I.第一CRISPR‑Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该第一多核苷酸序列包含：(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，(b)第一tracr配对序列，和(c)第一tracr序列，II.第二CRISPR‑Cas系统chiRNA多核苷酸序列，其中该第二多核苷酸序列包含：(a)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，(b)第二tracr配对序列，和(c)第二tracr序列，以及III.编码CRISPR酶的多核苷酸序列，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并且包含一个或多个突变，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中在转录时，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列分别杂交到该第一tracr序列和该第二tracr序列上，并且该第一指导序列和该第二指导序列分别引导第一CRISPR复合物和第二CRISPR复合物与该第一靶序列和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一CRISPR复合物包含与(1)可杂交到该第一靶序列上的该第一指导序列、和(2)杂交到该第一tracr序列上的该第一tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该第二CRISPR复合物包含与(1)可杂交到该第二靶序列上的该第二指导序列、和(2)杂交到该第二tracr序列上的该第二tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，并且其中该第一指导序列引导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割，并且该第二指导序列引导邻近该第二靶序列的另一条链的切割，从而诱导双链断裂，由此通过使脱靶修饰最小化来修饰该生物或该非人类生物。