一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺Ⅰ型军团菌的三重PCR检测方法

摘要

本发明一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺Ⅰ型军团菌的三重PCR检测方法，是一种军团菌属多重PCR检测方法，属于微生物分子检测领域。本发明利用分别针对军团菌属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团菌Ⅰ型的16S rRNA、danJ和ORF9基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺Ⅰ型军团菌的三重PCR方法。本发明方法简便、快捷、成本低、结果准确可靠，可以对分离培养到的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定。

主权项

一种用于公共场所集中空调通风系统冷却塔水和冷凝水中的快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺Ⅰ型军团菌的三重PCR检测方法，其特征在于步骤为：（1）制备PCR模板，挑取待检测可疑单个菌落于0.5mL灭菌无核酸酶的去离子水中，制备成菌悬液，100℃煮沸15min，冷却后备用；（2）引物序列：16S rRNA基因：上游引物5’‑AAGATTAGCC TGCGTCCGAT‑3’，下游引物5’‑GTCAACTTAT CGCGTTTGCT‑3’，预期扩增片段长度为654 bp；danJ基因：上游引物5’‑AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G‑3’，下游引物5’‑TGAATTCTGA CTTGCCCCAT G‑3’，预期扩增片段长度为285 bp；ORF9基因：上游引物5’‑CAGGATTACC GCTCATTATT G‑3’，下游引物5’‑GTAATTCCCA GCCATTTACC AGATC‑3’，预期扩增片段长度为561 bp；（3）PCR反应体系：1.6μL dNTP，浓度均为2μM的三种上、下游引物均各2μL，模板DNA  2μL，rTaq酶0.08μL，10×buffer缓冲液2μL，无核酸酶的去离子水补足至20 μL；（4）扩增条件：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s进行30个循环；72℃终末延伸5 min；（5）凝胶电泳：在1.5%琼脂糖凝胶、0.5×TBE缓冲液中电泳，电泳后凝胶成像获取结果；（6）判定方法：获得3条目的条带为嗜肺Ⅰ型军团菌LP1，两条目的条带为嗜肺军团菌LP，1条目的条带为非嗜肺军团菌非LP，0条目的条带为非军团菌。