一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法

摘要

一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法，属于生物工程技术领域。其包括以下工艺步骤：收集茶尺蠖触角总RNA；通过RT-PCR获得茶尺蠖气味结合蛋白的全长；构建茶尺蠖气味结合蛋白的原核表达载体；通过IPTG诱导茶尺蠖重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5）通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组气味结合蛋白与茶树叶片气味挥发物的结合反应谱，能使1-NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为13～45μmol/L的茶树叶片的挥发物确定为茶尺蠖的植物源引诱剂。本发明为茶尺蠖植物源气味信息引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。

主权项

一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）收集茶尺蠖触角总RNA；2）通过RT‑PCR获得茶尺蠖气味结合蛋白的全长；3）构建茶尺蠖气味结合蛋白的原核表达载体；4）通过IPTG诱导茶尺蠖重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5）通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组气味结合蛋白与茶树叶片气味挥发物的结合反应谱，能使1‑NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为13～45μmol/L的茶树叶片的挥发物确定为茶尺蠖的植物源引诱剂；所述的通过RT‑PCR获得茶尺蠖气味结合蛋白的全长具体包括：①茶尺蠖EoblGOBP2的引物设计根据Genbank中茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP2的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，为了后期表达时方便将目的基因克隆到表达载体上，在正反向引物上设计EcoR I和Hind Ⅲ的酶切位点；上游引物：5’‑GTGAATTCATGAAGTCTGTTCTGGTGGCGACGGT‑3’；下游引物：5’‑GGCAAGCTTGCTAATACTTCTCCATGACAGCTTC‑3’；②茶尺蠖GOBP2 cDNA的扩增、克隆和测序以反转录酶合成cDNA第一链为模板，用引物对其进行PCR扩增。经过对PCR条件进行优化，最终确定6个基因的PCR扩增程序：94℃预变性3 min；94℃ 30 s，62.1℃ 30 s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10 min；将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化，克隆于PMD 18‑T vector载体内，鉴定后测序，从而获得目的基因序列。