提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法

摘要

本发明公开了一种提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，是以棉花黄化苗茎尖分生组织为受体，通过对茎尖顶端分生组织进行“十”字形或“米”字形、0.6～1.0mm深度的划伤，再用农杆菌介导法将目的基因导入棉花，获得转基因植株。本发明方法具有转化效率高、重复性好的优点，实验证实，利用本发明所述的转化方法棉花平均转化率比改进前的平均转化率提高了30%，对棉花的遗传改良具有重要价值。

主权项

一种提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，步骤如下：a)棉花种子灭菌后于培养箱中暗处萌发，当下胚轴长到1～2cm后转入CoM固体培养基中，置暗处生长至株高为8～10cm的黄化幼苗，用于茎尖转化；上述CoM固体培养基是指在CoM培养液中添加了质量百分比为6％的琼脂而制得的培养基；其中所述CoM培养液是指用蒸馏水配制的含下述溶质的培养液，所述溶质及其浓度是：KNO₃ 1900mg/L，NH₄NO₃ 1650mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，KH₂PO₄·H₂O 170mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.30mg/L，H₃BO₃ 8.70mg/L，Na2MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，KI 0.8mg/L，盐酸硫胺素10mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，烟酸1mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30g/L；所述CoM培养液的pH为5.8～6.0；b)去掉黄化幼苗的种皮和一片子叶裸露出茎尖分生组织，然后划伤茎尖顶端；c)用脱脂棉球蘸吸浸染液，并将其放置在划伤后的黄化幼苗茎尖顶端部位，在负压条件下实施浸染；d)将浸染后的黄化幼苗于25～28℃，暗培养3±0.5天，然后光培养2～3天；e)将培养后黄化幼苗移栽入花盆，在温度25～28℃、湿度40～60％条件下培养，至生长出2～3片真叶；f)用脱脂棉球蘸吸选择剂，并将其放置在已长出2～3片真叶的转化苗茎尖顶端部位，实施抗性筛选，获得抗性植株；其特征在于：所述划伤茎尖的方法是：对茎尖顶端的分生组织作“十”字形或“米”字形划伤，并控制划伤伤口的深度为0.6～0.8mm；所述实施浸染的方法是：在真空负压为0.05～0.06MPa条件下，用吸有浸染液的脱脂棉球置于划伤后的黄化幼苗茎尖顶端部位，在温度25～28℃、空气相对湿度40～60％的条件下浸染10～12min；其中，所述浸染液组成是：在CoM培养液基础上添加了100～200mg/L的乙酰丁香酮和质量百分比浓度为0.01～0.02％的表面活性剂Silwet‑L77，以及含有重组外源基因的菌体浓度为OD₆₀₀＝0.6～0.8的农杆菌，所述浸染液pH为5.8～6.0；所述选择剂为除草剂，所述实施抗性筛选的方法是：在日温25～28℃、夜温20～22℃、相对湿度40～60％条件下，用吸有选择剂的脱脂棉球置于转化苗茎尖顶端部位12～24h，10～15d后观察植株芽尖顶端分生组织的存活情况选出抗性植株，转基因植株茎端生长点保持绿色，生长良好，非转化植株生长点发黑死亡；上述除草剂是氯磺隆，氯磺隆浓度是20～40mg/L。