脂多糖酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法

摘要

本发明公开了一种脂多糖(LPS))酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法，本发明利用化学反应原理对LPS进行改造，将LPS于BSA进行偶联，赋予LPS更好的免疫原性，促进小鼠体内特异性针对LPS的B细胞的增殖，进而提高单克隆抗体制备时的融合效率，最终获得高特异性，高亲和力，高灵敏度的抗LPS的抗体。

主权项

一种脂多糖(LPS))酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法，所述的方法包括如下步骤：a、LPS与载体蛋白BSA偶联复合物的制备：取LPS和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺(质量比6‑4∶2)溶解在PBS溶液中；搅拌状态下反应液里滴加含有碳二亚胺的PBS溶液中，室温反应过夜；将上清液逐滴加到含有BSA的磷酸盐缓冲液中；室温搅拌反应5h；装入透析袋透析、浓缩、干燥保存；b、抗LPS抗体的制备：选用BALB/C小鼠，将LPS‑BSA蛋白浓度调整为1mg/mL，然后取0.4ml蛋白与等量完全弗氏佐剂混合、乳化，每只100ul，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量腹腔加强免疫，每2周加强1次，加强后每隔7d眼眶采血，分别测定针对LPS和载体蛋白的抗体效价，于细胞融合前3d尾静脉加强免疫；用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠脾细胞，制备杂交瘤细胞；2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3‑4次克隆；每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗LPS的抗体；c、试剂盒的制备试剂盒的主要组分包括：包被抗体、LPS标准品、生物素标记的LPS、HRP标记的亲和素、5，5′‑四甲基联苯胺(TMB)和终止液(硫酸)；使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化；在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗LPS抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。