基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用

摘要

本发明公开了基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用，其中，测序文库构建方法包括：(1)在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)_n尾部，其中，n代表碱基C的数目；(2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)_n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)_m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目；以及(3)在所述双链DNA分子远离H(G)_m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，所述扩增产物构成所述测序文库。该方法能够有效地构建单链DNA分子的测序文库，特别是微量样本的测序文库。

主权项

一种基于单链DNA分子构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)_n尾部，以便获得具有Poly(C)_n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数；(2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)_n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)_m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数；以及(3)在所述双链DNA分子远离H(G)_m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，可选地，所述单链DNA分子是通过对RNA进行逆转录而获得的，可选地，所述单链DNA分子是通过对RNA进行逆转录而获得的cDNA分子，可选地，所述单链DNA分子是通过对双链DNA样本进行变性而获得的，可选地，所述单链DNA分子是通过对双链DNA样本进行热变性而获得的，可选地，所述双链DNA样本是通过染色质免疫共沉淀而获得的，可选地，所述双链DNA样本是通过对DNA样本进行随机打断而获得的，可选地，在所述随机打断之后，利用探针对所述随机打断的产物进行筛选，任选地，所述随机打断是通过超声处理进行的，可选地，在所述随机打断之后，对所述随机打断的产物进行末端修复处理，可选地，所述单链DNA分子的量为≥25pg，任选地，所述单链DNA分子的量为25pg～1000pg，可选地，所述单链DNA分子的长度为200～500nt，可选地，n为15～25之间的整数，优选地n为20，可选地，所述poly(C)_n尾部是利用末端转移酶形成的，可选地，在步骤(2)中，利用KAPA2G Robust HS获得所述双链DNA分子，可选地，m为9，可选地，所述延伸引物由SEQ ID NO：1所示的核苷酸构成，可选地，所述延伸引物具有筛选标记，其中，所述筛选标记形成于所述延伸引物的5’末端，可选地，所述筛选标记为生物素，可选地，在步骤(3)中，在所述双链DNA分子连接接头之后，进行扩增之前，对所述连接有接头的双链DNA分子进行纯化，其中，所述纯化是利用特异性识别生物素的珠子进行的，可选地，所述珠子为磁珠，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素，可选的，通过超纯蒸馏水72摄氏度加热对所述纯化产物进行洗脱，以便获得纯化的接有接头的双链DNA分子。