利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，该方法利用大肠杆菌通过分子克隆、融合蛋白、蛋白表达、蛋白纯化和酶活测定五个步骤重组表达切割蛋白酶。本发明的有益效果是，酶切效率高，重组周期短。

主权项

一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）、分子克隆，选择pET‑28a(+)为目标蛋白的载体，并且在His标签前段加入GST融合蛋白，以EcoR I和Not I为限制性酶切位点设计引物进行PCR实验扩增目的基因：上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC取一定量的上述PCR体系将扩增目的基因，利用琼脂糖凝胶电泳取鉴定PCR产物，如果出现500bp的条带则可以证明PCR得到了目标产物，可以进行下一步的胶回收和双酶切实验；（2）、融合蛋白，将胶回收后的PCR扩增产物与已连入GST蛋白序列的pET‑28a空载体分别进行双酶切反应，然后将双酶切得到的具有粘性末端的PCR产物和线性pET‑28a载体利用T4连接酶进行过夜连接，再将得到的的重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行质粒的扩增，提取DH5α中的重组质粒备用；（3）、蛋白表达，在重组质粒转化入E.coli ROSETTA菌株中后，进行小量蛋白的试表达，试表达成功后对转化入E.coli ROSETTA菌株中的重组质粒进行大量表达得到切割蛋白酶；（4）、蛋白纯化，将大量表达后的切割蛋白酶进行IMAC和肝素阳离子交换层析实验对其进行纯化；（5）、酶活测定，经过步骤（4）的纯化后，得到得到20℃，常压条件下适宜的切割蛋白酶，切割蛋白酶的酶活缓冲液为10mM MES，PH6.7，酶活缓冲液的蛋白体系终浓度15μM，底物体系终浓度为0.04mM。