主权项 |
大菱鲆弧菌LAMP检测方法,其特征在于包括下述步骤(1)根据大菱鲆弧菌LuxR基因,设计并合成以下两组单独使用的引物组合:引物组合一:FIP引物:5’‑ACTTCATCACGGGTTGACGCG‑CGCTGAAGATTGTCATTGGC‑3’BIP引物:5’‑AGCACCAACCGAACTAACCAGT‑CGTTACACACTTCGCCGC‑3’F3引物:5’‑ACCTCGCGAATTTGACATCA‑3’B3引物:5’‑CGTTGCAAGATCAGCAGGAT‑3’;引物组合二:FIP引物:5’‑CCAATGACAATCTTCAGCGATGAG‑CAAACAAAACCTCGCGAATT‑3’BIP引物:5’‑TAAAGTGTGGTTTGAGTGGAGC‑ACTGGTTAGTTCGGTTGGT‑3’F3引物:5’‑TCGACCTAGATTTACACGC‑3’B3引物:5’‑TCCATCGCTTTGATAAACATG‑3’;(2)配制LAMP反应体系反应体系的终浓度为:外引物F3和B3各5pmol/μl,内引物FIP和BIP各20pmol/μl,dNTP 0.25mM,Tris‑Cl 20mM,KCl 10mM,(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 10mM,MgSO<sub>4</sub> 2mM,0.1%Triton X‑100,8U Bst DNA聚合酶和1μl DNA模板,加双蒸水使反应体系总体积达到25μl;(3)LAMP反应体系扩增:将上述反应体系进行扩增反应,反应温度58℃到65℃,反应时间为30min到90min;(4)扩增产物检测:取扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳;或将产物加入SYBR Green I,观察反应管中颜色变化。 |