反转录聚合酶链反应检测转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA表达的方法

摘要

本发明涉及反转录聚合酶链反应检测转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA表达的方法，该方法包括以下的步骤：1）提取总RNA；2）毛囊干细胞RNA的逆转录体系；3）聚合酶链式反应；4）琼脂糖电泳：取扩增产物6μl上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在透射紫外光分析仪下摄影，并用激光光密度图象扫描仪扫描。本发明由于采用了上述的技术方案，实现了转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA的表达的检测。

主权项

反转录聚合酶链反应检测转染后毛囊干细胞中VEGF165mRNA表达的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：一、选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25％Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L‑谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；二、毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次；三、包装慢病毒：取对数生长期的293T细胞，提前24h接种于100mm培养皿中，待次日细胞长至50％‑70％即可；病毒包装采用钙转法进行：转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10％FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLenti‑IRES‑VEGF165‑EGFP10μg和3种包装质粒VSVG、RSV‑REV、RRE各5μg加入50μlHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH₂O至500μl作为B液，另准备500μlCaCl₂A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放置2min；逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10‑12h，更换为培养液为含10％FBS+DMEM高糖+1％双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45μm孔径滤膜过滤后，用超速离心机4℃，55000rpm/min离心3h，除去上清后，然后加100μl培养基吹打分装成2管，‑80℃保存病毒液；四、慢病毒感染毛囊干细胞：取培养的毛囊干细胞，提前1天按照1×10⁵/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50μl病毒原液和50μl补充培养基混匀的吹打后接种在预舖胶的24孔板，在37℃、5％CO₂培养箱静置30min，再补加400μl补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰毛囊干细胞；五、反转录聚合酶链反应检测转然后毛囊干细胞中VEGF165mRNA的表达1)提取总RNA：将接种了毛囊干细胞的六孔培养板置于冰上，吸去培养液；每孔加预冷的Trizol试剂1ml，反复吹打裂解充分后移入EP管中；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀后放置2‑3min；12000g,4℃离心15min；将上清液移入另一EP管中，约0.5ml，加等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10min，12000g，4℃离心10min，弃上清；用0.5ml DEPC处理的75％酒精1ml洗涤沉淀，7500g，4℃离心5min；倾去酒精，倒置EP管，干燥至酒精挥发；加适量的DEPC处理的水‑70℃冷冻备用；2)毛囊干细胞RNA的逆转录体系3)聚合酶链式反应PCR引物VEGF165蛋白引物设计，Action作为对照；a)PCR反应条件如下：b)PCR反应体系4)琼脂糖电泳：取扩增产物6μl上样，1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在透射紫外光分析仪下摄影，并用激光光密度图象扫描仪扫描。