用于检测结核分枝杆菌及其耐吡嗪酰胺药性的引物组

摘要

本发明涉及用于检测结核分枝杆菌及其耐吡嗪酰胺药性的引物组，利用该引物组检测结核分枝杆菌的耐吡嗪酰胺药性的方法是：提取样本中的DNA；通过荧光定量PCR扩增含有全长吡嗪酰胺酶基因(pncA)的结核基因组片段来检测结核分枝杆菌；对结核分枝杆菌阳性样本，进行吡嗪酰胺耐药性的检测，该检测的步骤为，1.以荧光定量PCR产物为模板再进行一次PCR反应添加体外表达元件；2.将此PCR产物加入到无细胞表达系统中，表达吡嗪酰胺酶；3.通过该样本与标准菌株的吡嗪酰胺酶活性对比，给出吡嗪酰胺耐药性结果。本发明将荧光定量PCR扩增全长pncA基因结合体外表达的吡嗪酰胺酶酶活性，实现了样本中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性的联合检测,无需细菌培养和DNA测序仪。

主权项

一种用于检测结核分枝杆菌及其耐吡嗪酰胺药性的引物组，其特征是由以下引物组成：定量PCR正向引物1：5'CGGACGGATTTGTCGCTCAC 3'，定量PCR反向引物1：5'GCCCGATGAAGGTGTCGTAGAAG 3'，定量PCR正向引物2：5'GGCGTCATGGACCCTATATCTGTGG3'，定量PCR反向引物2：5'CGGTGAACAACCCGACCCAGCC 3'；体外表达正向引物1：5'TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3'，体外表达反向引物1：5'ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3'，体外表达正向引物2：5'TAATACGACTCACTATAGGAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3'；体外表达反向引物2：5'ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3'；体外表达正向引物3：5'TAATACGACTCACTATAGGAAGGAGATAATGCATCATCATCATCATCACAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT 3'；体外表达反向引物3：5'ACCGCCGCCAACAGTTCATCCCGGT3'；利用上述引物组检测结核分枝杆菌的耐吡嗪酰胺药性的方法是：通过荧光定量PCR扩增含有全长pncA基因的结核分枝杆菌基因组片段来检测样本中是否含有结核分枝杆菌，所述pncA基因为结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶基因，如果出现阳性扩增就证明样本中含有结核分枝杆菌，则对其吡嗪酰胺耐药性进行检测；检测时，以荧光定量PCR的产物为模板，采用含有体外表达元件的引物，再次进行PCR扩增全长pncA基因，添加表达所需要的元件；然后将扩增的PCR产物加入到体外表达系统中，测定所表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酰胺酸的酶活性；所测得的酶活性，一方面作为辅助验证荧光定量PCR产物是否含有全长pncA基因，另一方面与采用同样方法表达和测定的结核分枝杆菌标准株吡嗪酰胺酶活性进行比较，据此得知样本中结核分枝杆菌是否发生了耐药突变，实现对其吡嗪酰胺耐药性的检测。