一种西兰花离体细胞快速增殖方法

摘要

本发明涉及一种西兰花离体细胞快速增殖方法，该方法包括以下步骤：⑴制备MS基本培养基；⑵西兰花离体细胞获得及接种方法：将当年西兰花种子冲洗消毒后得到无菌种子；无菌种子接种于MS基本培养基上，培养14d后得到无菌苗；切取胚芽并以正面朝上接种到MS诱导培养基上，于黑暗、温度为24~26℃条件下脱分化培养30d即得西兰花离体细胞；⑶西兰花离体细胞增殖方法：将西兰花离体细胞接种于MS增殖培养基上，于黑暗、温度为24~26℃条件下培养15~20d即可。本发明方法简便、快捷，可以定向调控离体细胞的快速增殖与发育，提高细胞的增殖速率，从而摆脱西兰花自然生长规律，缩短繁殖周期。

主权项

一种西兰花离体细胞快速增殖方法，包括以下步骤：⑴制备MS基本培养基：首先在1000mL的烧杯中，将4.5 g~5.5g的琼脂加入温度为85~95℃的蒸馏水中，充分搅拌至所述琼脂至完全溶解，得到琼脂水溶液；然后在所述琼脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、铁盐母液20mL、钙盐母液20mL、镁盐母液20mL、有机母液20mL、肌醇母液20mL，充分搅拌后加入30g的蔗糖，搅拌至蔗糖完全溶解后用蒸馏水定容至1000mL刻度处，搅匀后，加入浓度为0.1mol/L NaOH或浓度为0.1mol/L HCl调节pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分装为一瓶，经121℃灭菌20min后室温下水平静置冷却4h，即得MS基本培养基；所述大量元素母液是指含有硝酸铵82500mg/L，硝酸钾95000mg/L，磷酸二氢钾8500mg/L的混合液；所述微量元素母液是指含有MnSO₄·4H₂O 1115 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 430mg/L，硼酸248mg/L，碘化钾41.5mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 12.5mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.25mg/L，CoCl₂·6H₂O 1.25mg/L的混合液；所述铁盐母液是指含有FeSO₄·7H₂O 1390mg/L，Na₂^.EDTA^.2H₂O 1865mg/L的混合液；所述镁盐母液是指含有MgSO₄·7H₂O 18500 mg/L的溶液；所述钙盐母液是指含有CaCl₂·2H₂O 22000 mg/L的溶液；所述有机母液是指含有烟酸25 mg/L，盐酸吡哆醇25 mg/L，盐酸硫胺素25 mg/L，甘氨酸100 mg/L的混合液；所述肌醇母液是指含有肌醇5000 mg/L的溶液；⑵西兰花离体细胞获得及接种方法：将当年西兰花种子用清水冲洗20~40min后，先用质量浓度为75%的酒精消毒0.25~0.75min，再用质量浓度为1% NaClO消毒2~6min，得到无菌种子；所述无菌种子用无菌水涮洗4~5次并接种于所述MS基本培养基上，在光照强度为4000~6000LX、温度为24~26℃条件下培养14d后得到无菌苗，其中每40~60mL所述MS基本培养基中接种5~8颗种子；切取长度为5mm的胚芽并以正面朝上接种到MS诱导培养基上，其中每40~60mL所述MS诱导培养基中接种4~6个胚芽，于黑暗、温度为24~26℃条件下脱分化培养30d即得西兰花离体细胞；所述MS诱导培养基是指首先在1000mL的烧杯中，将4.5 g~5.5g的琼脂加入温度为85~95℃的蒸馏水中，充分搅拌至所述琼脂至完全溶解，得到琼脂水溶液；然后在所述琼脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、铁盐母液20mL、钙盐母液20mL、镁盐母液20mL、有机母液20mL、肌醇母液20mL，充分搅拌后加入30g的蔗糖，搅拌至蔗糖完全溶解，得MS基本培养基混合液；其次在所述MS基本培养基混合液添加2.0mg的6‑苄氨基腺嘌呤与1.0mg的2,4‑二氯苯氧乙酸，后用蒸馏水定容至1000mL刻度处，搅匀后，加入浓度为0.1mol/L NaOH或浓度为0.1mol/L HCl调节pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分装为一瓶，经121℃灭菌20min后室温下水平静置冷却4h即得；⑶西兰花离体细胞增殖方法：将所述西兰花离体细胞接种于MS增殖培养基上，于黑暗、温度为24~26℃条件下培养15~20d即得，其中每40~60mL所述MS增殖培养基中接种4~6块且每块0.05~0.1g的所述西兰花离体细胞；所述MS增殖培养基是指首先在1000mL的烧杯中，将4.5 g~5.5g的琼脂和200mg水解酪蛋白分别加入温度为85~95℃的蒸馏水中，充分搅拌至所述琼脂和所述水解酪蛋白至完全溶解，得到琼脂蛋白水溶液；然后在所述琼脂蛋白水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、铁盐母液20mL、钙盐母液20mL、镁盐母液20mL、有机母液20mL、肌醇母液20mL，充分搅拌后加入30g蔗糖，搅拌至蔗糖完全溶解，得MS基本培养基混合液；其次在所述MS基本培养基混合液添加1.7mg的6‑苄氨基腺嘌呤与0.9mg的萘乙酸，后用蒸馏水定容至1000mL刻度处，搅匀后，加入浓度为0.1mol/L NaOH或浓度为0.1mol/L HCl调节pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分装为一瓶，经121℃灭菌20min后室温下水平静置冷却4h即得。