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一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法，其具体步骤如下：步骤1 构建GST‑RalGDS‑RBD原核表达质粒查询NCBI数据库中人RalGDS基因对应798‑885位氨基酸残基的编码序列,对照原核表达载体pGEX‑6P‑1的多克隆位点(图1所示), 选择其中的BamH I和EcoR I位点作为酶切位点设计上游引物(5′‑CGCGGATCCGCGctgccgctctacaacc‑3′)和下游引物(5′‑ CCGGAATTCCGGtcagaagatgcccttggcaa‑3′)，以人肝文库为模版，PCR扩增得到目的片段；经过琼脂糖凝胶电泳分离后用凝胶回收试剂盒回收，回收的目的片段和pGEX‑6P‑1空载体分别经BamH I和EcoR I双酶切后，再次经过琼脂糖凝胶电泳分离回收，回收的目的片段和载体以5:1的比例混合；然后用T<sub>4</sub> DNA连接酶于16℃连接过夜，随后用该体系转化DH5α大肠杆菌，涂平板并挑选其中的阳性克隆，所选的阳性克隆经过限制性内切酶切后得到大约418bp的目的片段；GST‑RalGDS‑RBD原核表达质粒测序得到的目的片段和NCBI数据库上的编码序列完全一致；步骤2 GST‑RalGDS‑RBD融合蛋白的原核表达和纯化用上述构建的GST‑RalGDS‑RBD质粒转化BL21大肠杆菌，按1%转接于100 mL LB培养基中，37℃ 180 r/min 振荡培养至对数生长期(D<sub>600nm</sub>=0.6);随后按100 µM/L终浓度加入IPTG，20℃ 180 r/min 振荡诱导过夜；次日4℃ 4000 rpm 10min离心收集菌液，将得到的大肠杆菌用30 mL缓冲液PB[30 mL PBS中含0.5 mM/L DTT、2 μg /mL Aprotimin、2 μg /mL Leupeptin、1 mM/L PMSF、1 mM/L Na3VO4、10 mM/L NaF]重悬，然后高压破碎，随后超声波进一步破碎；4℃ 13000 rpm 10min离心裂解产物，取上清，将预先经过平衡的300 μL谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠与离心后得到的上清混合，4℃混旋转2h，然后预冷的PB缓冲液洗涤谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠，利用洗脱缓冲液[5ml配方：250 μL 1M/L Tris‑Cl,ph7.6、4.75mL 超纯水、0.0154g 还原型谷胱甘肽]把GST‑RalGDS‑RBD从凝胶珠上洗涤下来；最后利用SDS‑PAGE考马斯亮蓝染色方法检测纯化的GST‑RalGDS‑RBD融合蛋白；步骤3 使用GST pull‑down和Western‑Blot方法检测Rap1的活性水平将HEK293细胞接种于100 cm<sup>2</sup>培养皿，待细胞长到80%密度时，利用脂质体转染质粒Rap1V12 (rap1基因组成型活性形式，表达产物相当于Rap1‑GTP)；24h后收集细胞，先用PBS洗一次，然后用IP buffer裂解液冰上裂解细胞，12000 rpm离心10 min,取上清，留取其中20%作为对照；转染Rap1V12的细胞上清均分为两份，分别与偶联了GST空载体和GST‑RalGDS‑RBD的谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠混合，置摇床上4℃混旋转1h，4℃ 6000 rpm离心，用IP裂解液洗涤三次，最后用微量进样器吸干Ep管内所有剩余液体，加入30 μl SDS‑PAGE loading buffer，煮沸10 min，最后通过western‑blot检测目标Rap1蛋白；结果如图5所示，其中以GST空载体作为阴性对照，GST‑RalGDS‑RBD能够与HEK293细胞中表达的Rap1‑GTP发生相互作用，并且这种相互作用具有很强的特异性。 |
