一种南极冰藻CPD光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用

摘要

本发明公开了一种南极冰藻CPD光修复酶，如（a）或（b）所述的蛋白质：（a）其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；（b）将（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有CPD光修复酶活性的由（a）衍生的蛋白质；本发明同时公开了所述南极冰藻CPD光修复酶的编码基因、表达载体，以及该南极冰藻CPD光修复酶在化妆品、生物医药相关领域的应用。本发明首次克隆了南极冰藻CPD光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量CPD光修复酶，并将CPD光修复酶应用到化妆品、生物医药等相关领域，能够主动修复由紫外线引起病症，带来巨大的社会效益，意义重大。

主权项

南极冰藻CPD光修复酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：一.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE‑L CPD光修复酶cDNA序列的获得A、南极冰藻的培养、总RNA的分离将南极冰藻4℃培养至对数期，用Invitrogen公司的Trizol进行RNA的提取；试验按照Trizol试剂的提取流程说明进行操作，在整个过程中保证无RNase污染，将提取的RNA分装成小份，冻存于‑80℃冰箱备用；B、CPD光修复酶基因cDNA序列的获得根据前期获得的冰藻转录组序列设计引物：5’‑RACE引物GSP1:CGAGCACATGGGTCGTTCCTCTTATCG3’‑RACE引物GSP2:TGGGACGGAAGTGGAGGGATGAGGT将获得的高质量RNA进行反转录，合成cDNA；5’‑RACE反转录体系如下：3’‑RACE反转录体系如下：轻微振荡后离心数秒钟；于42℃ 90min，70℃ 10min，冰上急冷2min以上；用Tricine‑EDTA buffer稀释，保存于‑20℃，待用；PCR反应体系如下：PCR反应条件为：94℃ 30s，72℃ 3min，5个循环；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 3min，5个循环；94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min，27个循环；PCR结束后用1.0％的琼脂糖进行回收，连接到pMD18‑T，转化E.coli DH5α，进行测序验证；利用NCBI在线工具,即http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，将所得序列应用BLAST程序进行序列同源性比对和相似性分析；用DNAstar软件进行序列拼接，并在NCBI中比对，以确认获得目的基因为光修复酶基因的完整编码区序列；二.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE‑L CPD光修复酶表达载体构建A、根据测序得到的光修复酶基因完整序列设计引物：CPDF:TAGAATTCATGCCGAAGCGAACCPDR:TATCTCGAGTCAAGCTCGTGGCPCR反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，55℃退火1min，72℃延伸2min反应进行30个循环；B、将光修复酶基因的PCR扩增产物和原核表达载体pET‑28a(+)分别用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ于37℃酶切2h，用1.0％的琼脂糖分别进行回收，将纯化好的目的片段及载体用T4 DNA连接酶于16℃下连接16h，连接体系如下；C、将连接好的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，步骤如下：(1)取感受态细胞300μL于1.5mL离心管中，冰浴5min；(2)于每管中加入5μL连接过的质粒，轻轻旋转以混合内容物，冰浴30min；(3)42℃热休克90s，不要摇动试管；(4)取10mL无菌试管，每管加入800μL LB液体培养基，冰浴；(5)取转化后的细胞200μL加入800μL LB液体培养基中，37℃ 150rpm振荡培养45min；(6)将100μL转化的菌液涂布于平板表面，37℃培养12～16h；D、挑取白色的菌落分别置于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h，碱裂解法提取质粒以进行酶切鉴定；鉴定正确的质粒以相同方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，测序鉴定得到重组菌株BL21(DE3)/pET‑28a(+)/phr；三.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE‑L CPD光修复酶的纯化A、将重组菌BL21(DE3)/pET‑28a(+)/phr接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃振荡过夜培养；次日取5mL菌液接入500mL相同的培养基继续培养2～3h直至OD600为0.6后，加入终浓度为1mM的IPTG，于10℃振荡培养24h，8000g离心10min，收集菌体；B、Ni琼脂糖亲和柱亲和层析：将金属螯合剂Ni琼脂糖装入层析柱，用1×Ni柱结合缓冲液平衡；将上清液上柱；一般用40mM咪唑洗脱，得到目的蛋白，即所述南极冰藻CPD光修复酶，所述南极冰藻CPD光修复酶是如(a)所述的蛋白质：(a)其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。