一种快速灵敏的GⅡ型诺如病毒微阵列基因芯片检测方法

摘要

本发明涉及一种快速灵敏的GⅡ型诺如病毒微阵列基因芯片检测方法。本发明的检测方法整合了聚合酶链式反应PCR和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上；检测方法包括：RNA液提取，PCR扩增，杂交，清洗，结果判读。本发明能对GⅡ型诺如病毒进行快速灵敏的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止诺如病毒导致的腹泻传染病疫情的发生。

主权项

一种快速灵敏的GⅡ型诺如病毒微阵列基因芯片检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)粪便样本RNA液提取；(2)RT‑PCR扩增：a.RT‑PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液,特异性正、反向引物，PCR Grade H2O,PCR质控品,逆转录/DNA聚合酶液，RNA提取液；b.将RT‑PCR反应液加入已固化特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩增反应；所述的特异性引物根据RdRP基因片段、ORF1与ORF2交界处基因片段两段保守基因进行设计；所述的特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计能够区别其他物种，特异性引物和探针为：RdRP基因片段GⅡ1‑F:5’‑GAGTATGGTCTCAAGCCAACCCGTCC‑3’(SEQ ID NO 1)GⅡ1‑R:5’‑ACGTGCTCAAGTCTGAGAACCTCATC‑3’(SEQ ID NO 2)Probe1:5’‑TACTTAGACAGATGTATTGGAC‑3’(SEQ ID NO 3)和ORF1与ORF2交界处基因片段(4993‑5336)GⅡ2‑F:5’‑CGTGCCCAGCCAAGAGCGATGTTCAG‑3’(SEQ ID NO 4)GⅡ2‑R:5’‑ATCAGGGCCCAAGGGCGCGCTCCA‑3’(SEQ ID NO 5)Probe2：5’‑GCGATCGCAATCTGGCTCC‑3’(SEQ ID NO 6)或根据RdRP基因片段、ORF1和ORF2交界处基因片段两段保守基因之一设计的特异性引物和探针：RdRP基因片段GⅡ1‑F:5’‑GAGTATGGTCTCAAGCCAACCCGTCC‑3’(SEQ ID NO 1)GⅡ1‑R:5’‑ACGTGCTCAAGTCTGAGAACCTCATC‑3’(SEQ ID NO 2)Probe1:5’‑TACTTAGACAGATGTATTGGAC‑3’(SEQ ID NO 3)或ORF1与ORF2交界处基因片段(4993‑5336)GⅡ2‑F:5’‑CGTGCCCAGCCAAGAGCGATGTTCAG‑3’(SEQ ID NO 4)GⅡ2‑R:5’‑ATCAGGGCCCAAGGGCGCGCTCCA‑3’(SEQ ID NO 5)Probe2：5’‑GCGATCGCAATCTGGCTCC‑3’(SEQ ID NO 6)(3)杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内杂交反应；(4)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；(5)结果判读。