一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法

摘要

本发明公开了一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法。首次将SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法DNA提取技术与Glassmilk(玻璃奶)DNA纯化技术结合应用于阿胶DNA提取中。所需阿胶浆的用量控制在0.3-0.5ml，阿胶块可控制在0.2-0.6mg，提取出的DNA浓度高、纯度极好，稳定不易降解。提取的DNA可以扩增100-500bp的序列片段，可开展后续的基因克隆、测序等分子生物学实验。该方法操作简单、用量少、耗时短，尤其适用于深度加工而导致的核酸含量偏少和高度降解的各种类型阿胶产品DNA的提取,为利用DNA分子生物学鉴定技术实现阿胶源性鉴别提供基础。

主权项

一种快速从阿胶中提取DNA的方法，其特征在于具体实施步骤如下：步骤一，试剂配制及实验器材准备：消化液、缓冲液配制，准备2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；步骤二，用消化液消化分解蛋白：用移液枪吸取200‑300μl的阿胶浆至2ml无菌离心管中；或称取0.3‑0.5mg即食阿胶羹，液氮研磨成粉末状至2ml无菌离心管中，分别向离心管中加入400μl细胞消化液，加入380μl 5%的Chelex‑100，然后置于50‑60℃水浴中保温，期间不时轻轻搅拌混匀，直到胶状物全部溶解；待溶液冷却至室温后，加入20μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，56℃放置1 h，期间不时轻微摇匀；步骤三，核酸释放：高速震荡5‑10s，100℃  8min；步骤四，核酸纯化：12000rpm，离心10min，吸取上清转至新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min，小心将上清转至新的离心管中；向收集液体中加入Glass Milk 5μl，加600μl gDNA Binding Buffer，充分混匀，65℃水浴15min，中间反转几次；室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底沉淀；70%酒精500μl，洗涤，8000r/min离心1min，重复此步骤2次；加入500μl无水乙醇；吹打悬浮，洗涤，8000r/min离心1min，弃上清；8000r/min离心 30s，用10μl移液器吸走残余液体，室温干燥10min；步骤五，洗脱DNA:加50μl pH 7.0的TE缓冲液，70℃水浴5min，12000rpm，离心1min，吸取上清转移至新的离心管中，‑20℃保存；步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度；步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计驴和马的特异性通用引物；步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；步骤九，基因序列比对：将测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，进行后续的分子生物学分析；其中所述细胞消化液的组成：由10 mM Tris‑HCl，25mM EDTA，100mM NaCl，0.5% SDS构成，pH为8.0；5%的Chelex‑100的配制：称取5g Chelex‑100，用灭菌的ddH₂O定容至100ml；gDNA Binding Buffer的组成：6M NaI。