一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法

摘要

本发明涉及一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明将小鼠离体的阴道组织剪成1cm×0.5cm大小后进行清洗，然后用Dispase Ⅱ过夜培养，再将过夜培养的阴道组织进行分离，弃固有层组织，上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA混合后进行消化，最后采用含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到的细胞悬液经过滤、离心后，依次采用PBS、EPILIFE重悬，然后置于37℃、5%CO₂培养箱培养，2天后首次换液，以后每两天换液1次。该方法不仅操作方便，而且获取的细胞数量大，纯度高，活力多，且能稳定的传代4-5代，能对阴道上皮的生理、病理变化，癌变过程及组织工程化阴道的构建提供种子细胞。

主权项

一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），取小鼠离体的阴道组织，将其剪成（0.9‑1.1）cm×（0.4‑0.6）cm大小，然后用4℃含双抗的PBS作为清洗液进行清洗，清洗至清洗液澄清后，将阴道组织与2U/ml的中性蛋白酶Ⅱ型按照1:1.9‑2.1的体积比混合，4℃冰箱过夜；步骤（2），将经步骤（1）过夜培养的阴道组织进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，然后将上皮层组织与0.25%胰酶‑0.02%EDTA按照1:1.9‑2.1的体积比混合，于37℃消化阴道上皮层组织9.5‑10.5min，然后用无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散，再于37℃消化阴道上皮组织9.5‑10.5min后，再次无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散后，加入与0.25%胰酶‑0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液；步骤（3），将步骤（2）得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液离心，弃上清，然后再加入是步骤（1）0.25%胰酶‑0.02%EDTA体积的1‑1.5倍的PBS 重悬细胞，再次离心，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*10⁵‑1*10⁶个/ml，放于培养瓶内，然后置于37℃、5%CO₂培养箱培养，第2天后首次换液，换液时，用无菌枪头弃去旧培养基，加入是步骤（1）0.25%胰酶‑0.02%EDTA体积的1‑2倍的PBS以洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去PBS后，再加入是步骤（1）0.25%胰酶‑0.02%EDTA体积的6‑7倍的新的EPILIFE，继续放入37℃、5%CO₂的CO₂培养箱培养，以后每两天换液1次；到第7‑9天细胞的融合度达到80%‑90%，就可传代。