孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法

摘要

本发明公开了一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，本发明以孔鳐软骨为原料，通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)，ESI-MS测定分子量为700.71 Da；制备的高活性抗氧化肽具有较强的自由基清除活性和良好的脂质过氧化抑制作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等进行开发。

主权项

孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）孔鳐软骨总蛋白粗提物的制备：称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的孔鳐软骨浸于4～6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中，于4 ℃下搅拌抽提36～48 h；提取液在4 ℃下以4000～6000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质；将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用pH值 为 7.6Tris‑HCl的缓冲液于4 ℃下透析24～48 h，透析袋内溶液即为孔鳐软骨总蛋白粗提物；2）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取孔鳐软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在‑20 ℃下静置4～6 h后，于4 ℃、10000～12000 r/min高速离心20 min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得孔鳐软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白；3）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取孔鳐软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5 mL溶于Tris‑HCl缓冲液，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入胰蛋白酶，于40 ℃酶解3～5 h，然后于90 ℃、10 min灭酶活，酶解液于4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液；4）孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化肽；其中，所述步骤1）中的盐酸胍溶液含0.02 mol/L MES、0.02 mol/L EDTA，pH值为7～8；步骤3）中的Tris‑HCl缓冲液为0.05mol/L，pH值为7.5～8.5；胰蛋白酶为1.9×104 U/g。