窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法。本发明要解决的技术问题是为分析窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌提供一种新选择。本发明的技术方案是窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法，包括如下步骤：a、标准曲线的制备；b、提取基因组DNA；c、扩增；d、定量分析。本发明方法可用于分析窖泥中的梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的变化趋势。

主权项

窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法，其特征在于：包括如下步骤：a、标准曲线的制备：设计针对梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的标准细菌的特异性引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；b、提取基因组DNA：利用洗脱、酶消化结合的方法提取窖泥微生物群落的宏基因组；所述的洗脱、酶消化结合的方法的具体如下：称取1g窖泥样品于50mL离心管，向离心管加入5mL PBS缓冲液pH7.64和8～9颗灭菌玻璃珠，漩涡震荡5min，200×g离心5min，在冰上吸取上清液；在沉淀中加入5mL PBS缓冲液重复洗涤两次，合并三次上清液，12000rpm离心5min，取沉淀；加入1mL CTAB抽提液和20μL巯基乙醇至离心管中，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入5μL 20mg/mL蛋白酶k，37℃220r/min 30min，室温6000×g离心10min，收集1mL上清；加入等体积Tris‑饱和酚‑氯仿‑异戊醇，抽提一次，12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿‑异戊醇12000rpm离心10min，取上清，重复两次；上清液加入0.6倍体积预冷的异丙醇，‑20℃沉淀1h，12000rpm离心10min，倒掉液体；沉淀用70％乙醇洗涤，12000r/min离心10min；洗涤后的DNA吹干后TE溶解，‑20℃冰箱保存备用；所述的CTAB抽提液配方为2％CTAB、5mol/L NaCl、1mol/L pH8.0的Tris‑HCl、0.5mol/L EDTA；Tris‑饱和酚‑氯仿‑异戊醇的体积比25︰24︰1；氯仿‑异戊醇的体积比24︰1；c、扩增：采用梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异性引物，对窖泥微生物宏基因组中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异性片段进行扩增；d、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌进行定量分析；所述步骤a和c中扩增梭菌的特异性引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述步骤a和c中扩增乳酸菌的特异性引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述步骤a和c中扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；所述步骤a和c中扩增甲烷菌的特异性引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。