应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法

摘要

本发明涉及一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，首先建立sgRNA文库；然后用慢病毒包装sgRNA文库，并收集病毒；之后在癌细胞系中筛选sgRNA文库；再提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA；最后富集基因组DNA中的sgRNA。与现有技术相比，本发明对CRISPR/Cas细胞的筛选过程做了改进，利用被感染细胞的puromycin抗性，用简便的方法确定了病毒感染效率，确定了病毒MOI值；更重要的是，限制性内切酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低非特异性PCR扩增产生的假阳性，能够高效扩增sgRNA的DNA模板，提高了建库效率。

主权项

一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)sgRNA文库建立：设计待筛选癌症基因群的sgRNA，或直接购买靶向于全基因组sgRNA文库，sgRNA的载体采用Lenti CRISPRv2；(2)用慢病毒包装sgRNA文库：无菌条件下，培养293FT细胞，并用转染试剂X‑tremeGENE HP DNA Transfection Reagent将Lenti CRISPRv2及另外两种病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293FT细胞中，培养细胞，收获病毒液；(3)sgRNA文库在细胞中的筛选：选取合适的病毒量，感染待检测的癌细胞系，感染48小时后，用puromycin筛选2天，所得阳性细胞收取部分作为对照组，其他细胞继续培养至40‑46天后收取作为实验组；(4)提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA：用细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀后，加入RNase酶，65℃孵育30分钟，再加终浓度为10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育过夜，用纯化液抽提DNA片段；(5)富集基因组DNA中的sgRNA：用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，37℃反应过夜，将酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔点琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收1600‑2000bp的DNA片段；(6)sgRNA文库构建与测序：文库按照建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。