猪胸膜肺炎放线杆菌内毒素快速检测试纸条

摘要

本发明涉及一种猪细菌病内毒素检测试剂显示的器具，特别是涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌内毒素（ApxIV）快速检测试纸条，试纸条含支撑层、反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片条，反应试剂载体吸附层粘贴于支撑层上，从样品测试端依次为纤维层，ApxIV金标单抗或多抗纤维层，纤维素膜层，手柄端为吸水材料层；分别用ApxIV配对单抗或多抗或单抗溶液在纤维层上喷检测印迹“｜”、 “/” 或“＼”，分别用羊（兔）抗小鼠或猪IgG的多抗或用SPA溶液在纤维素膜层上喷对照印迹“｜”、 “/” 或“＼”。该试纸条特异、敏感、直观、准确、简便、快速，能在畜禽饲养、肉类加工和检疫等相关部门推广应用。

主权项

一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌内毒素ApxIV的检测试纸条，该试纸条含有支撑层和吸附层，支撑层为不吸水的薄片层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上制备有检测印迹和对照印迹，其特征是金标抗体纤维层吸附有纳米级金颗粒标记的抗ApxIV单克隆抗体，检测印迹用抗ApxIV的配对单抗或多克隆抗体印制，对照印迹用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白印制；或金标抗体纤维层吸附有纳米级金颗粒标记的抗ApxIV的多克隆抗体，检测印迹用抗ApxIV的单抗制备，对照印迹用金黄色葡萄球菌A蛋白或抗猪IgG多抗制备；其中，ApxIV单克隆抗体的制备方法如下：用50μg～100μg ApxIV抗原免疫Balb/c系小鼠三次，每次间隔15～30d；第三次加强免疫后3～4d，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，用75％酒精浸泡5～10min，无菌条件下取其脾脏，剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×10⁸个脾细胞与2～5×10⁷个NS0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，将含有沉淀细胞的离心管置于37℃的水中，并缓缓加入0.7～1ml 40％～50％PEG4000作用1min，所述PEG4000的pH为8.5～9.0，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板，100μl～200μl/孔，置于37℃5％CO₂培养箱中培养；培养7～10d后，以5μg～10μg/ml的纯化的病原体特异抗原包被96孔酶标板，以酶联免疫吸附试验检测杂交瘤的培养上清，挑取OD₄₅₀≥0.5的强阳性细胞克隆，进行连续三次的有限稀释法克隆化，获得阳性杂交瘤细胞株，其染色体数为92～98，其分泌的单克隆抗体能够特异识别ApxIV，而不与其它毒素发生交叉反应，亲和力常数达10^9～10，轻链亚型为к或λ，重链亚型为IgG₁、IgG_2a、IgG_2b或IgG₃。