采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法

摘要

一种采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法，属于生物技术领域。本发明的目的是采用CRISPR-CAS9基因敲除技术成功获得人类低磷性佝偻病模型的采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法。本发明的步骤是：sgRNA表达载体的构建，CAS9mRNA的合成，受精卵的获取和显微注射，受精卵的培养和发育。本发明成功获得低磷性佝偻病模型，该模型的获得能够有效地模拟人类疾病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。

主权项

一种采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法，其特征在于：①sgRNA表达载体的构建：在PHEX基因第1个外显子处设计2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链制备sgRNA，其中两对寡聚核苷酸为：sgRNA1:TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG和AAACCCAGAGGCACTCGAATTG；sgRNA2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC和AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG；合成的寡聚核苷酸经退火，退火条件是：95℃ 5min后自然降至室温，连入经 BbsⅠ酶切经回收PUC57‑sgRNA表达载体，完成sgRNA载体构建；其中：酶切体系：质粒PUC57      20μl                      10×buffer        20μl                      BbsⅠ            1μl                      ddH₂O            159μl酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；②CAS9mRNA的合成：CAS9表达质粒经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中；酶切体系：NotⅠ        4μlCAS9     50μl                BSA      30μl                Triton     30μl               10×H   30μl             ddH₂O     156μl酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；③受精卵的获取和显微注射：注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中CAS9mRNA浓度为150ng/μl，sgRNA浓度为30ng/μl；④受精卵的培养和发育：将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中。