蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇在制备抑制癌细胞的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种蚯蚓纤溶活性蛋白，是通过以下方法制备得到的：取新鲜蚯蚓，加水匀浆，静置，离心得蛋白上清液，盐析，离心，沉淀溶于水中，得蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物，该粗提物经透析脱盐、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶柱脱盐除杂操作，冷冻干燥成为固体粉末，并在分离过程中采用细胞实验筛选活性蛋白，最终得到纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白。通过实验研发现，蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇联合使用，可以在体外抑制肿瘤细胞生长，因此，蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇可以用于制备抑制癌细胞的药物。本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞的联合用药物，包括蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。

主权项

蚯蚓纤溶活性蛋白，其特征在于：是通过以下方法制备得到的：取新鲜蚯蚓，清洗干净，加入蚯蚓质量1～4 倍的水，匀浆，静置12 小时；4000rpm 离心20 分钟得蛋白上清液；蛋白上清液用0℃硫酸铵盐析，离心，弃上清，得到的沉淀溶于水中，得到蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物，该粗提物经透析脱盐、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶柱脱盐除杂操作，冷冻干燥成为固体粉末，并在分离过程中采用细胞实验筛选活性蛋白，最终得到纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白；所述透析脱盐截留分子量大于3500 道尔顿；所述阴离子交换层析具体为：将透析完全的蛋白粗提物溶液过 DEAE 阴离子交换柱，上样体积与柱体积相当，流动相 A 液为 50Mm pH8.0 Tris‑HCl 溶液，B 液为 1M NaCl 50Mm pH8.0Tris‑HCl 溶液,梯度洗脱，收集 5%～20%B 液阶段洗脱出的各个蛋白峰，以聚乙二醇 20000 溶液为透析介质进行浓缩脱盐；考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，计算各蛋白峰得率，并进行细胞实验筛选活性，选择活性和得率最高的蛋白，选择原则为：得率相差不大时，选择活性高的，活性相差不大时，选择得率高的；选择后，进行下一步凝胶过滤层析；所述凝胶过滤层析具体为：上述选择的活性和得率最高的蛋白进行 S200 凝胶过滤层析，流动相为 0.15M 氯化钠溶液，收集蛋白峰，冻干浓缩，细胞实验筛选活性，选择活性和得率最高的蛋白，进行下一步凝胶柱脱盐；所述凝胶柱脱盐除杂具体为：采用 G10 凝胶柱对上述筛选得到的蛋白进行脱盐操作，流动相为水，收集蛋白峰，冻干得固体粉末，即为蚯蚓纤溶活性蛋白；所述细胞实验筛选活性的方法具体为：MCF‑7 细胞在细胞瓶内铺满时，倾去培养基，加入1mL0.25%胰酶消化，待细胞从瓶壁上脱落后，加入1mL 培养基终止消化，1000rpm，离心5min，然后加入2mL 培养基重悬，取10μL 细胞悬液，稀释至100μL，然后进行细胞计数，调整细胞密度为8*10⁴/mL,以每孔100μL 的比例将细胞悬液铺至96 孔板内，置于37℃，5%CO₂ 的培养箱内培养，12h 后，将各个蛋白峰用培养基配制成适当浓度，吸净96 孔板内培养基，将蛋白药液以每孔100 微升的比例加入到各个孔中，重新置于37℃，5%CO₂ 的培养箱内培养，48 小时后，各孔内加入10 微升CCK‑8 试剂，1h 后，以450nm 为测定波长，670nm 为参比波长，利用酶标仪测定吸光度值，计算各蛋白峰的抑制率百分比。