利用生殖特异性启动子表达cre的重组酶载体

摘要

一种利用生殖特异性启动子表达cre的重组酶载体，属于生物技术领域。本发明的目的是利用VASA基因的生殖特异性表达，来建立转基因猪模型的利用生殖特异性启动子表达cre的重组酶载体。本发明载体的构建方法是：①VASA转录起始位点上游序列扩增与纯化；②VASA转录起始位点上游序列测序；③VASA-Cre表达载体构建。本发明利用基因工程技术构建了一个生殖系统特异表达cre重组酶的质粒，并且重组质粒可以在药物压力下独立于细胞染色体外存在。该质粒可以保证在生殖系统中特异表达cre重组酶，可以与loxp相结合，进行相关生殖系统表达基因的敲除，为cre重组酶系统的发展和相关基因的研究起到积极的推动作用。

主权项

一种利用生殖特异性启动子表达cre的重组酶载体，其特征在于：①VASA转录起始位点上游序列扩增与纯化：根据VASA转录起始位点上游4118 bp序列设计引物，同时分别在上下游引物5’‑端引入NheI与ScaI酶切位点，以正常小型猪基因组为模板，利用Taq plus Mix扩增VASA启动子区片段；引物序列如下所示：VASA‑F：5' GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3'VASA‑R：5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3，PCR 反应体系包括2×Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2各0.5ul, Temple 0.1 μg ,H₂O To 10 μl；②VASA转录起始位点上游序列测序：纯化片段检测后，利用 T4 DNA 连接酶连接到 pGM‑T 载体，连接反应体系包括：10×Ligase Buffer 1ul；回收片段 6ul ；pGM‑T Vector 0.5ul；T4 DNA ligase 1ul ;H₂O To 10 μl；③VASA‑Cre表达载体构建：利用4300bp猪源VASA转录起始位点上游序列驱动Cre重组酶表达的表达载体是通过替换实验室保存的诱导性表达Cre重组酶载体pET28a‑Mx1‑Cre‑BGHpo1yA‑   FRT2neo中Mx1序列完成的，构建载体为pET28a‑VASA‑Cre‑BGHpo1yA‑FRT2neo，基因序列SEQ　ID　NO：1，命名为：VASA‑Cre，载体全长：12,088 bp。