一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法

摘要

本发明属于生物分析与检测技术领域，具体为一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法。本发明首先在Fe₃O₄@PEG磁性纳米材料表面修饰醛基、环氧基和三氟乙磺酸酯基等活性基团，再在其外层键合上含有二硫键的基团，得到磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG@ADC；然后采用两步酶解的策略：先用胰蛋白酶进行第一步酶切，使疏水性的膜蛋白暴露出亲水性的羧基；然后再进行还原烷基化，破坏未被酶切的肽段与材料之间的二硫键；从材料表面洗脱下来的残余肽段继续被Glu-C酶解。实验证明，两步酶解策略对于特殊膜蛋白，如细菌视紫红质，具有很好的酶解效果，在复杂样品的膜蛋白组学研究中也有很好的结果。本发明实用高效，重复性好，稳定性高，在膜蛋白的大规模鉴定中有广阔的应用前景。

主权项

一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过一系列反应将半光胺和乙酰半胱氨酸中的两个巯基相连，形成由二硫键连接氨基与羧基而得到的化合物，记为ADC；（2）利用ADC的氨基与表面修饰有三氟乙磺酸酯基的磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG‑tresyl进行反应，形成表面含有丰富羧基的新型磁性纳米材料，记为Fe₃O₄@PEG@ADC；（3）将膜蛋白键合到新型磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG@ADC表面；（4）用胰蛋白酶进行第一步酶解，使疏水性的膜蛋白暴露出亲水性的羧基，然后再进行还原烷基化，破坏未被酶切的肽段与材料之间的二硫键，将材料表面的残余肽段洗脱下来；再进行第二步酶解，即选用活性位点为谷氨酸的Glu‑C进行残余肽段的酶解。