一种快速微藻种属鉴定方法

摘要

本发明公开了一种快速微藻种属鉴定的方法。主要步骤为：将单藻落挑取至事先加入10~20μL水的PCR管中，或者含藻水体离心收集藻细胞104~106个后加入10~20μL水的PCR管中，将藻细胞吹打散开后，直接将PCR管置于PCR仪中，于99℃加热20~30min，再次吹打使DNA释放作为模板，以真核细胞通用18s rDNA或ITS引物进行PCR反应。通过对产物测序和序列分析，可获得待测藻株的种属信息。该方法利用直接热裂解后释放出DNA进行PCR反应，无需微藻的扩培及提取DNA，大大地节约时间和节省成本，达到快速、准确鉴定的目的。

主权项

一种快速微藻种属鉴定方法，其步骤如下：1)从固体培养基上挑取0.1～3mm大的待测藻落或在含藻水体中离心收集待测藻细胞10⁴～10⁶个，至已加入10～20μL水的PCR管中；2)预处理：将藻反复吹打散开后，将PCR管置于PCR仪上，99℃加热20～30min后放凉至4℃，然后再次反复吹打，使加热裂解的藻细胞DNA释放到溶液中，将其作为模板；3)以上述预处理得到的DNA为模板，按下述要求进行扩增检测；扩增过程采用下述两者均分别操作或选择其一操作过程；真核细胞通用18s rDNA引物，序列为：18s‑F 5'‑CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT‑3'，18s‑R 5'‑CCCGGGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC‑3'；所述扩增检测中采用的18s‑PCR反应体系组成包括上述预处理得到的基因组DNA 5～10μL，10～20μM 18s‑F，10～20μM 18s‑R，200～500μM dNTPs，5μL10×PCR缓冲液，0.5μL LA Taq，然后用无菌ddH₂O补足到50μL；所述18s‑PCR扩增检测中PCR扩增条件为：93～95℃3～5min；93～95℃30～60s，50～60℃30～60s，68～72℃1～2min，共28～35个循环；68～72℃延伸6～10min；ITS引物序列为：ITS‑F 5’‑GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG‑3’，ITS‑R 5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’；所述扩增检测中采用的ITS‑PCR反应体系组成包括上述预处理得到的基因组DNA 5～10μL，10～20μM ITS‑F，10～20μM ITS‑R，200～500μM dNTPs，5μL10×PCR缓冲液，0.5μL LA Taq，然后用无菌ddH₂O补足到50μL；所述ITS‑PCR扩增检测中PCR扩增条件为：93～95℃3～5min；93～95℃30～60s，50～60℃30～60s，68～72℃30～60s，共30～40个循环；68～72℃延伸6～10min；4)将第步骤3)中18s‑PCR得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，得到大小在1600～1800bp的基因片段产物，可将此产物经亚克隆测序；ITS‑PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，得到大小在600～800bp的基因片段产物，可将此产物经亚克隆测序；5)序列结果分析：测序结果通过GenBank数据库进行比对，找出与待测藻落或待测藻细胞同源性最接近的藻种，若找出的藻种与待测藻落或待测藻细胞的同源性大于等于97％可初步认定是同一种，同源性小于97％的不能确定是否是同一种，只能确定待测藻落或待测藻细胞与找出的藻种的亲缘关系比GenBank数据库中其它藻种的亲缘关系更近；6)本发明所述快速微藻种属鉴定方法适用于绿藻、金藻和硅藻。