一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法

摘要

本发明涉及一种绵羊精原干细胞的分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法，包括制备各种溶液，然后从3-4月龄的绵羊睾丸中取2-3g曲细精管组织块，经过两步酶解消化制备单细胞悬液，进而用差别贴壁法分离纯化精原干细胞，使用SSCM培养液实现绵羊精原干细胞的传代长期培养，对传代长期培养的绵羊精原干细胞进行冻存和复苏的方法。本发明提供的技术方案实现了不需使用特定的绵羊精原干细胞抗体就能获得纯度较高的绵羊精原干细胞，建立了绵羊精原干细胞传代长期培养体系、成功地建立了液氮冷冻法长期保存绵羊精原干细胞的方法。使用本发明提供的方法分离纯化并且传代的绵羊精原干细胞至少已经培养达40代以上，如果加上冻存时间，最长的培养期已达4年。

主权项

一种绵羊精原干细胞分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：配制溶液：1)将体积百分比为0.1％的抗菌‑抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液A，两周内使用；2)将IV型胶原酶以20mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成IV型胶原酶储备液，‑20℃保存；3)将透明质酸酶以10mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成透明质酸酶储备液，‑20℃保存；4)将Dnase I以5mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液，再加入体积百分比为20％的甘油，制成DNase I储备液，‑20℃保存；5)将体积百分比为0.5％的Trypsin和浓度为2mM EDTA溶于PBS缓冲液中制成Trypsin/EDTA储备液，‑20℃保存；6)将体积百分比为10％的胎牛血清和0.1％的抗菌‑抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液C，两周内使用；7)将体积百分比为5.5％的马血清、2.4％的胎牛血清和0.1％的抗菌‑抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液B，两周内使用；8)将30μΜ的β‑硫基乙醇加入培养液C中，过滤灭菌制成培养液D，现配现用；9)将体积百分比为0.52％的牛血清白蛋白溶于PBS缓冲液中，过滤灭菌制成PBS‑BSA溶液，现配现用；第二步：应用两步酶解法制备绵羊睾丸组织单细胞悬浮液，无菌条件下操作步骤依次如下：1)从3‑4月龄的绵羊睾丸中取2‑3g曲细精管组织块，放入载有2.5ml培养液A的100ml培养皿中，用镊子除去曲细精管组织块上的睾丸白膜和较大的血管；2)将所剩的组织块放入20ml小瓶中，用眼科直剪刀剪碎，持续剪3分钟；3)将剪碎的组织块转移到一个100ml带盖的大口瓶中，补加培养液A至7.5ml；4)进行第一步酶消化，具体操作如下：在上述100ml带盖的大口瓶中加入0.63ml的IV型胶原酶储备液，置于37℃水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡40min；然后加入0.825ml的透明质酸酶储备液和0.125ml的DNase I储备液，继续置于37℃水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡20min；5)从水浴摇床中取出100ml带盖的大口瓶，用10ml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次；6)将步骤5)所述100ml带盖的大口瓶中的悬浮液转入50ml离心管，以2000rpm的转速离心6min，除去上清液；7)在步骤6)所述离心管中加入12ml的PBS缓冲液，摇匀使沉淀物重新悬浮，以2000rpm的转速离心6min，除去上清液；8)重复步骤7的操作一次；9)进行第二步酶解，在步骤8)所述离心管中加入0.75ml的培养液A重新悬浮沉淀物，再加入1ml的Trypsin/EDTA储备液和0.25ml的DNase I储备液，置于37℃水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡10min，用10ml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次；10)在步骤9)所述离心管中加入10ml的培养液C，用10ml移液管温和地上下吸吹悬浮物直到明显的块状物消失；11)将步骤10)所述离心管以2000rpm的转速离心6min，除去上清液，然后用2ml培养液C重悬细胞；12)先用200目尼龙过滤器然后用300目尼龙过滤器分别过滤步骤11)所述细胞悬浮液；13)将步骤12)所述的过滤后的细胞悬浮液用10ml移液管温和地吸吹5‑10次，进行细胞计数，然后加入培养液C调整细胞密度至1.25x10⁶细胞/ml，制成单细胞悬浮液；第三步：从第二步所述单细胞悬浮液中纯化精原干细胞，操作步骤依次如下：1)将10ml第二步步骤13)所述的单细胞悬浮液铺于直径为100mm的明胶包被培养皿，放在32.5℃,5.5％CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中，培养2天半至3天半；2)用5ml移液管从步骤1)中所述培养皿中温和地移除所有培养液；3)先用培养液A洗细胞：从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的培养液A，温和地来回晃动培养皿1次，然后用移液管移除培养液；4)再用PBS缓冲液洗细胞两次：从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的PBS缓冲液，温和地来回晃动培养皿1次，立即用移液管移除上清液，再重复操作一次；5)加4ml培养液A至培养皿中，用移液管吸吹培养液A轻轻冲洗培养皿整个表面2遍；6)将步骤5)所述培养皿中的冲洗液转移到无菌的50ml离心管中；7)将步骤6)所述离心管于2000rpm离心6min，移去上清液，保留细胞沉淀；8)在步骤7)所述离心管中加入4ml的培养液B重悬细胞；9)在collagen Ⅰ包被的培养皿中加入4ml培养液B，再铺上步骤8)所述细胞悬浮液，然后将培养皿放进32.5℃、5.5﹪CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2小时；10)从培养箱中取出培养皿，用5ml移液管温和地在培养皿表面反复吸吹5‑10次，使细胞混合，再将培养皿放回培养箱中继续培养2小时；11)从培养箱中取出培养皿后，用5ml移液管在培养皿中温和地吸吹细胞悬浮液，直至冲洗过整个培养皿表面，再用5ml移液管从培养皿中收集collagen Ⅰ不吸附的细胞悬浮液，全部转移到50ml离心管中；12)将步骤11)所述离心管在2000rpm下离心6min，沉淀细胞，除去上清液，用4ml培养液D悬浮细胞，然后吸取细胞悬浮液通过200目尼龙过滤器，用50ml试管收集滤液；13)迅速地将步骤12)得到的滤液用5ml移液管温和的吸吹4‑5次，然后将混合好的滤液按每孔1ml铺入Laminin包被的12孔培养板，其中所述培养板预先准备好，临用时先移除每个孔中的上清液，再加入1ml培养液A清洗，移除所有培养液A后才铺入上述滤液；14)将步骤13)所述培养板置于32.5℃，5.5﹪CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中孵育20‑40分钟，然后取出，用1ml微量移液管非常温和的吸吹所述培养板的培养孔表面一遍，使孔中的细胞悬浮液上下层混合，然后迅速放回培养箱中继续孵育10‑30分钟；15)将步骤14)所述培养板取出，用1ml微量移液管吸吹一次，使孔中细胞悬浮液混合均匀，此时悬浮液中的细胞为Laminin不粘附细胞，将这些细胞悬浮液从培养孔中移走，然后，立即在培养孔中加入1ml新鲜配制的培养液D，再用1ml微量移液管吸吹培养孔表面一遍，然后移走培养孔中的培养液D，立即再次向孔中加入1ml新鲜配制的培养液D，培养液D要温和且均匀地滴加在孔的整个表面，孔中粘附的细胞为Laminin粘附细胞；16)用1ml微量移液管从步骤15)所述培养孔中移走培养液D，然后立即向培养孔内加入1ml新鲜配制的PBS‑BSA溶液，然后将培养板放入32.5℃，5.5﹪CO₂，饱和湿度的细胞培养箱内，孵育3‑6分钟，同时在一个50ml的无菌试管中加入4ml培养液D备用；17)将步骤16)所述培养板取出，立即用1ml移液管在培养孔中温和的吹吸PBS‑BSA溶液5‑10次，使Laminin粘附细胞从培养孔上脱壁，收集含有Laminin粘附细胞的PBS‑BSA溶液，将含有Laminin粘附细胞的PBS‑BSA溶液转移到含有培养液D的50ml离心管中；18)将步骤17)所述离心管在2000rpm转速下离心6min，移除上清液，倒转试管，温和地除去剩余的液体；19)在步骤18)所述离心管中加入1ml培养液D重新悬浮细胞，用细胞计数板测定细胞密度；20)通过免疫荧光细胞染色法鉴定步骤19)所述细胞悬浮液中的细胞就是绵羊精原干细胞。