一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法

摘要

本发明涉及一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法。该方法包括如下步骤：采集完整果实，洗净后用乙醇擦拭表面，再用乙醇浸泡，无菌水冲洗，然后用0.1％升汞浸泡，冲洗后吸干，纵向剖开果荚，取出粉末状种子；将种子投入藻酸钠包埋液，搅拌均匀后将其滴入至钙离子包埋液中，置于室温下凝固成包埋珠；将包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20-160min；放入冷冻管中，并加入PVS2溶液，然后将冷冻管置于液氮中冷冻保存；当需要使用种子时，将冷冻管取出，解冻后除去PVS2溶液，并洗涤；将洗涤后的包埋珠接种到固体VW培养基上培养，使种子萌发，待幼苗长至6-10cm高时可驯化移栽。该方法得到的种子萌发率高，且可节约成本。

主权项

一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、种子的采集与灭菌：采集成熟未开裂的完整果实，将果实先洗净，再用75％乙醇擦拭表面，接着用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2‑3次，然后用0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗4‑5次，将果实表面的水分吸干，纵向剖开果荚，取出粉末状种子；S2、包埋：将粉末状种子投入藻酸钠包埋液，搅拌均匀，将含有种子的藻酸钠包埋液滴入至钙离子包埋液中，置于室温下使其充分凝固成包埋珠；所述藻酸钠包埋液的配方为：VW培养基+2％藻酸钠+2.0mol·L^‑1甘油+0.4mol·L^‑1蔗糖；所述钙离子包埋液的配方为：0.1mol·L^‑1CaCl₂+2.0mol·L^‑1甘油+0.4mol·L^‑1蔗糖；所述包埋珠的直径为3‑6mm，每个包埋珠中含有25‑35粒白及种子；S3、脱水：将上述制得的包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20‑160min；S4、冷冻保存：将脱水后的包埋珠放入冷冻管中，并加入PVS2溶液，然后将含有种子包埋珠的冷冻管置于液氮中冷冻保存；S5、解冻与洗涤：当需要使用种子时，将冷冻管从液氮中取出，迅速置于38℃的水浴中解冻2‑4min，解冻完成后及时除去PVS2溶液，并用洗涤液洗涤3次，每次8‑12min；S6、种子的萌发：将洗涤后的包埋珠接种到添加0.7％琼脂粉的固体VW培养基上培养，使种子萌发，待幼苗长至6‑10cm高时可驯化移栽。