母乳脂肪酸谱数据库的建立方法

摘要

本发明公开了一种母乳脂肪酸谱数据库的建立方法，包括以下步骤：取多个母乳样品；将每个母乳样品与甲醇进行酯化反应，反应完成后，将反应液离心，取上层有机相；将所述有机相注入SPE固相萃取小柱，用洗脱液淋洗SPE同相萃取小柱，收集流出液，N₂吹干，获得纯化的脂肪酸甲酯；利用气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱，采用归一法计算得到每个母乳样品中各类脂肪酸的含量；建立母乳脂肪酸谱数据库。本发明提供的母乳脂肪酸的测定方法，能够快速、准确地测定母乳脂肪酸的含量，了解不同人群哺乳期母乳脂肪酸种类和含量的变化特征，从而建立母乳脂肪酸谱数据库，指导我国企业生产出真正适合婴儿的配方奶粉。

主权项

一种母乳脂肪酸谱数据库的建立方法，包括以下步骤：(1)收集初乳、二周乳、六周乳，产妇母乳取量为30mL，分装于1.5mL冻存管中，于‑40～‑80℃储存；(2)向10mL体积的螺口试管中加入100μL母乳和2.0mL的体积比为4:1甲醇:苯混合溶液，充分混匀后，缓慢加入0.2mL乙酰氯，边加边摇匀；再以Teflon膜作内衬，旋紧试管螺旋盖，将试管置于100℃水浴保温1小时，每隔20min进行震荡摇匀，加速脂肪酸的甲酯化；水浴结束后，将试管置于室温放置，待其冷却；(3)向已冷却的试管中加入5mL 6％的碳酸钾摇匀，试管在3000r/min条件下离心10分钟；将上层有机相用玻璃吸管小心吸出至事先放有2mL蒸馏水的圆底试管中，振荡混匀，静置分层后，再将上层有机相转移至事先装有200mg无水Na₂SO₄的尖头离心管中；将上层有机相移入尖头离心管后，轻轻振荡，若发现其中的无水Na₂SO₄可以跳动，证明没有水分掺杂；再将上层有机相转移至一个具塞试管中；如果无水Na₂SO₄不能跳动，说明有水分掺杂在脂肪酸甲酯中，需重新进行静置分层，吸取上层有机相，直至振荡试管时，无水Na₂SO₄可以跳动；(4)将2mL正己烷2～5s内过完SPE固相萃取小柱，再将待纯化样品快速过柱；用正己烷清洗具塞试管两次，两次的用量分别为2mL和1mL，之后快速过柱；然后，用3mL 5％乙醚‑正己烷溶液缓慢清洗SPE固相萃取小柱，液体成滴收集到具塞试管中，并在38℃水浴下N₂吹干，得到相应的脂肪酸甲酯；最后，先用3mL体积比为2:1的氯仿:甲醇溶液，再用3mL正己烷慢速清洗柱子，冲洗速度为成滴滴下；(5)用100μL正己烷重新融解N₂吹干的脂肪酸甲酯，并至于样品瓶中，取2μL样品进样，利用岛津GC‑14C型气相色谱仪安捷伦DB‑23色谱柱测定样品的脂肪酸成分；分析条件为：进样口温度270℃，进样体积：2μL，检测器温度：270℃，载气：N₂，流速：2.30mL/min，气体配比：氮气:氢气:空气比为：20:7:5，柱温：140℃，柱温升温程序：140℃，保持2min，以10℃/min升至160℃，保持2min；以10℃/min升至220℃，保持4min；以10℃/min升至240℃，保持6min；(6)采用GC‑14C型气相色谱仪测定脂肪酸，用杭州英谱科技开发有限公司HS色谱数据工作站V4.0采集谱图，并处理分析所采集的谱图数据；色谱峰采用混合的Sigma脂肪酸甲酯标样来进行鉴定；谱图采集处理采用对比标准品保留时间的方法定性，采用面积归一法求各色谱峰面积，计算母乳中脂肪酸的含量。