利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法

摘要

本发明公开了一种利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，包括将HIV-1整合酶基因和加强型绿色荧光蛋白基因融合克隆进真核表达载体pTRE-2hyg，通过转染级别的质粒提取试剂盒，抽提pTRE-2hyg-EGFP-IN质粒，用于细胞转染实验，将重组质粒pTRE-2hyg-EGFP-IN转染HeLa Tet-Off Advanced Cells，诱导融合蛋白的表达，进行药物筛选，能抑制整合酶细胞核定位的药物判定为阳性结果。本发明利用Tet-off诱导表达系统，针对整合酶-LEDGF/p75靶点，高通量筛选整合酶抑制剂，能稳定可靠的对HIV-1整合酶抑制剂进行筛选，对于整合酶抑制剂的筛选是极大地进步。本发明材料来源广泛，效果显著，重复性好，应用前景好。

主权项

一种利用Tet‑off诱导表达系统高通量筛选HIV‑1整合酶抑制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：将HIV‑1整合酶基因和加强型绿色荧光蛋白基因融合克隆进真核表达载体pTRE‑2hyg，插入点为多克隆位点，酶切位点BamHI和NotI之间，构建表达载体pTRE‑2hyg‑EGFP‑IN；并通过双酶切和基因测序，对构建的载体进行鉴定；鉴定正确以后，通过转化大肠杆菌，培养细菌；通过转染级别的质粒提取试剂盒，抽提pTRE‑2hyg‑EGFP‑IN质粒，用于细胞转染实验；步骤二：1）取pTRE‑2hyg‑EGFP‑IN和Lipofectamine2000，分别用Opti‑MEM I 培养基稀释，室温放置5分钟；2）将二者混合、摇匀，室温放置20分钟，备用；3）稀释HeLa Tet‑Off Advanced Cells到不含抗生素的培养基中，并加到细胞培养板的孔中；4）将步骤2）中的混合液加入细胞培养孔并轻轻摇晃混匀，放置在37℃含有体积百分比浓度为5% 的CO₂的培养箱培养；5）培养4小时后，弃掉培养液，用含100μg/ ml的G418和1μg/ ml的多西霉素的完全培养基继续培养；6）继续培养8小时后，进行药物筛选；弃掉培养液，用DMEM培养基洗三次，每次3分钟；7）用完全培养基稀释待检药物，加入培养孔，设立不加药物的空白对照；8）培养12小时，用质量百分比为4%的多聚甲醛固定细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察整合酶的定位情况，能抑制整合酶细胞核定位的药物判定为阳性结果；采用Hoechst33342染色指示细胞核。