生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法

摘要

本发明公开了生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法。属生物技术领域。首先克隆木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β-葡萄糖苷酶基因；构建含这三种酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体和毕赤酵母表达载体；将表达载体转化相应的宿主菌；分别筛选高表达葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌重组子和毕赤酵母重组子作为工程菌。发酵枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌生产的重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。本发明解决了用天然菌株生产混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶中遗留的酶产量低的关键问题，有利于降低其酶产品的价格。

主权项

生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β‑葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，A.通过分子生物学技术克隆木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β‑葡萄糖苷酶基因；B.构建枯草芽孢杆菌整合组成分泌型表达载体和毕赤酵母整合组成分泌型表达载体，枯草芽孢杆菌整合组成分泌型表达载体上含有枯草芽孢杆菌的rDNA序列，含以上所述三种酶基因的表达框架，并且在表达框架中，含有引导蛋白分泌的α因子信号肽序列，毕赤酵母整合组成分泌型表达载体上含有毕赤酵母的rDNA序列，含以上所述三种酶基因的表达框架，并且在表达框架中，含有引导蛋白分泌的α因子信号肽序列；C.将枯草芽孢杆菌整合组成分泌型表达载体转化枯草芽孢杆菌、将毕赤酵母整合组成分泌型表达载体转化毕赤酵母，通过载体上的rDNA序列引导载体整合于宿主菌基因组，从而获得枯草芽孢杆菌重组子和毕赤酵母重组子；D.分别筛选高表达以上所述的三种酶的枯草芽孢杆菌重组子和毕赤酵母重组子作为含葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β‑葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌；E.发酵工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β‑葡萄糖苷酶，在信号肽的引导下，工程菌表达的葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β‑葡萄糖苷酶分泌到细胞外，收获不含工程菌细胞的重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β‑葡萄糖苷酶。