基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明的方法主要步骤包括：（1）食品致病菌亚型DNA的提取，（2）扩增引物及核酸探针序列设计，（3）基于非对称PCR的扩增反应，（4）纳米金探针的制备，（5）胶体金核酸试纸条的制备，（6）样品的检测。本发明可以快速、特异、灵敏、定性和定量检测食品样本中的食品致病菌及确定致病菌的特定亚型，其探针设计简单，操作步骤简短，产物为单链，易于检测，方便推广。

主权项

一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于具体包括如下步骤：(1)食品致病菌亚型基因组DNA的提取提取食品致病菌亚型的基因组DNA；(2)扩增引物及核酸探针序列设计根据步骤(1)得到的食品致病菌亚型的基因组的保守序列设计两对PCR的引物，包括用来标识T线的基因的前引物1和后引物2，及用来标识IACL线的基因的前引物3和后引物4；设计一条与基因组序列不能完全互补配对的一段共用序列；胶体金标记探针：设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列互补配对的标记在胶体金上且3’添加有一段多聚T尾的探针序列；CCT线捕捉探针：设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列相同且3’添加有一段多聚T尾的CCT线捕捉探针序列；IACL线捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的内部控制线捕捉探针；T线捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的T线捕捉探针；(3)非对称PCR扩增反应扩增反应：反应体系包括步骤(1)提取的基因组DNA；步骤(2)中所述的前引物1、后引物2、前引物3、后引物4和共用序列；以及dNTP、聚合酶、聚合酶缓冲液和双蒸水；(4)纳米金探针的制备纳米金的制备：用柠檬酸盐还原法以氯金酸为原料制备纳米金；纳米金探针的制备：将步骤(2)中所述的胶体金标记探针与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；(5)胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板进行组装：底板在最下层，硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于硝酸纤维素膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；所述的金垫包埋有步骤(4)制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素的检测线、含链霉亲和素的内部控制线和含链霉亲和素的控制线；(6)样品的检测将由步骤(3)得到的退火杂交产物与4×SSC缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加4×SSC缓冲液，读取结果，检测线、内部控制线和控制线都变成红色表明有靶片段存在，即有待测食品致病菌亚型；仅有控制线变成红色，表明完全没有所检测的食品致病菌亚型；控制线和内部控制线变成红色表明检测菌种为所检测的食品致病菌但不是待检测的亚型；步骤(2)中所述的食品致病菌亚型的基因组的保守序列为食品致病菌所测亚型特有保守的基因片段；所述的食品致病菌所测亚型特有保守的基因片段为李斯特菌的prs基因或单增李斯特菌4b型亚型特有的GenBank:GE305625.1的ORF2819基因片段；所述的食品致病菌亚型为单增李斯特菌4b型亚型；一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的方法如下：步骤(2)中用来标识T线的基因为GenBank:GE305625.1的ORF2819基因片段，其PCR引物序列为：前引物1：5’‑AGCAAAATGCCAAAACTCGT‑3’；后引物2：5’‑CCCCCATATATATATATCCCCCCCATCACTAAAGCCTCCCATTG‑3’；用来标识IACL线的基因为PRS基因，其PCR引物序列为：前引物3：5’‑GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG‑3’；后引物4：5’‑CCCCCATATATATATATCCCCCCCAAAGAAACCTTGGATTTGCGG‑3’；步骤(2)中所述的共用序列为5’‑CCCCCATATATATATATCCCCCC‑3’；步骤(2)中所述胶体金标记探针序列为：5’‑GGGGGGATATATATATATGGGGGTTTTTTTTTTTT‑SH‑3’；步骤(2)中所述CCT线捕捉探针序列为：5’‑CCCCCATATATATATATCCCCCCTTTTTTTTTTTT‑Bio‑3’；步骤(2)中所述IACL线捕捉探针序列为：5’‑Bio‑TTTTTTTTTTTTCTTCTTTCGCAATCTCTTCAGC‑3’；步骤(2)中所述的T线捕捉探针序列为：5’‑BioTTTTTTTTTTTTACGAGTTTTGGCATTTTGCT‑3’；所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法为非诊断治疗目的的方法。