用于在木霉属的蛋白酶缺陷突变体中产生多肽的方法

摘要

本发明涉及用于在木霉属的蛋白酶缺陷突变体中产生多肽的方法，具体涉及亲本木霉属菌株的突变体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码多肽和一个或多个选自下组的基因：第一和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一和第二天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，其中一个或多个基因经修饰使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，分别在一种或多种选自下组的酶的产生方面有缺陷：第一和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一和第二天冬氨酸蛋白酶，和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。本发明还涉及产生此类突变体中的多肽的方法，和用于产生此类突变体的方法。

主权项

一种亲本木霉属(Trichoderma)菌株的突变体，其包含编码多肽的多核苷酸和一个或几个选自下组的基因：第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中(i)所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因经修饰使得所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，在第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的产生方面有缺陷；(ii)所述第一天冬氨酸蛋白酶基因经修饰使得所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，在第一天冬氨酸蛋白酶的产生方面有缺陷；(iii)所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因经修饰使得所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，在胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的产生方面有缺陷；(iv)所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因经修饰使得所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，在第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的产生方面有缺陷；(v)所述第二天冬氨酸蛋白酶基因经修饰使得所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，在第二天冬氨酸蛋白酶的产生方面有缺陷；或(vi)所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、所述第一天冬氨酸蛋白酶基因和所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因经修饰使得所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，在第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、第一天冬氨酸蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的产生方面有缺陷；其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶选自下组：(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或其成熟多肽具有至少80％同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；其中所述第一天冬氨酸蛋白酶选自下组：(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少80％同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶选自下组：(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少80％同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶选自下组：(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:100或其成熟多肽具有至少80％同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:99或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；其中所述第二天冬氨酸蛋白酶选自下组：(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:108或其成熟多肽具有至少80％同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；和其中所述多肽对于所述里氏木霉菌株是外源的。