一种制备及快速分离胞内单宁酶的方法

摘要

本发明涉及一种制备及快速分离胞内单宁酶的方法，属于生物发酵和生物分离工程领域。本发明公开的一种制备及快速分离胞内单宁酶的方法，首先配置液体发酵培养基，灭菌、冷却；往冷却后的培养基内接入无花果曲霉孢子悬液进行液体发酵，制得无花果曲霉胞内单宁酶；发酵结束后，将发酵液冷冻离心，收集湿菌体，通过超声和液氮研磨进行无花果曲霉细胞破壁，离心收集粗酶液；对离心后的粗酶液进行单宁酶纯化。本发明采用液体发酵能制备胞内单宁酶，发酵条件较好控制，不易污染杂菌，生产效率高，能随时检测酶活力，且检测过程中杂质干扰小。采用液体发酵方式研究了细胞内产生的单宁酶的性质，为单宁酶的综合开发提供参考。

主权项

一种制备及快速分离胞内单宁酶的方法，包括以下步骤：(1)配置液体培养基，灭菌、冷却；(2)液体发酵：往冷却后的液体培养基内接入无花果曲霉孢子悬液进行发酵，制得无花果曲霉胞内单宁酶；(3)无花果曲霉细胞破壁：发酵结束后，将发酵液冷冻离心，收集湿菌体，通过超声和液氮研磨进行无花果曲霉细胞破壁，离心收集粗酶液；(4)单宁酶纯化：将粗酶液用硫酸铵沉淀、沉淀溶解后超滤，利用混合表面活性剂反胶束体系进行萃取，收集到的酶液经冷冻干燥制备成单宁酶粉末；所述的无花果曲霉为无花果曲霉Gim3.6，无花果曲霉孢子悬液接入量为1.5mL，悬液浓度为1×10⁸个孢子/mL；所述的混合表面活性剂反胶束体系萃取，前萃取水相为超滤后的粗酶液，有机相体系为：助溶剂正丁醇和有机溶剂异辛烷体积比为1:3，以CTAB和Tween‑60为混合表面活性剂，混合表面活性剂在有机相体系中含量为5g/L，CTAB和Tween‑60质量比2:1，其中有机相体系和水相体积比为2:1，前萃取温度为40℃，振荡时间15min；反萃取水相为2mol/L的NaCl溶液，其中有机相体系和水相体积比为2：1，反萃取温度为40‑45℃，pH为5.0‑5.5，振荡时间为30‑40min；步骤(2)中所述的液体培养基由麦芽汁、酵母膏、五倍子组成，所述的麦芽汁锤度为10°Bx，酵母膏质量百分含量为2％，五倍子含量为20g/L；适合此培养基的发酵条件为：培养温度30‑35℃，转速为180r/min的摇床中振荡培养72‑80h。