一种双层平板两次培养筛选原油降解菌方法

摘要

本发明涉及一种双层平板两次培养筛选原油降解菌方法，设计的固体双层平板，下层是牛肉膏蛋白胨琼脂营养平板，将待分离菌液涂布在该培养基上，通过倒置培养，分离单菌落；再在该培养过的营养琼脂平板上，倾注一层以原油为唯一碳源的琼脂糖培养基，正放培养，通过第二层原油平板培养筛选出降油单菌落，因此通过两次培养，得到原油降解菌株。此方法解决了现有原油降解菌在分离筛选过程中单细胞菌体在原油培养基中难生长、时间长、效率低的问题，克服传统方法繁琐的转接过程，以及培养基表面原油较多使一些生长慢的单细胞目标菌漏缺的不足。

主权项

一种双层平板两次培养筛选原油降解菌方法，其特征在于：该方法中采用双层平板进行两次培养，其中，下层平板为牛肉膏蛋白胨培养基，上层为以原油为唯一碳源的无机盐琼脂糖培养基；下层培养基进行菌株分离，并长成单菌落，上层培养基作为降油菌株的鉴别筛选使用，通过两次培养，得到原油降解菌株，具体步骤如下： （1）样品的采集：采集油田原油污染的土壤，保存；（2）原油降解菌的富集培养：以原油为唯一碳源的无机盐培养基进行富集培养，连续转接多次；（3）原油降解菌群的分离：将（2）中的富集培养液做梯度稀释，取0.1ml稀释度为10⁵~10⁸的富集培养液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，倒置于30℃恒温培养箱中，培养2天左右，待平板长出旺盛单菌落；（4）原油降解菌的筛选：对（3）中菌落进行标记，用灭菌竹签分别插在菌落一侧，并在其平板上缓慢注入40℃以原油为唯一碳源的无机盐琼脂糖培养基，使其覆盖于菌落之上，并在对应菌落处用无菌竹签轻轻搅动，待凝固后，换上瓦盖盖于平皿上，将双层平板正放于30℃恒温培养箱中进行第二次培养，培养时间2~4周，挑取在菌落周围形成透明水解圈的菌落，进一步在原油培养基划线分离纯化出单菌落。