鱼鳃组织石蜡切片的制备方法

摘要

本发明公开了一种鱼鳃组织石蜡切片的制作方法，包括固定、脱钙、脱水、透明、石蜡渗透、包埋、切片、黏片和展片、脱蜡复水、染色、复染和封固等步骤。本发明较现有石蜡切片制作方法改进了脱水、透明、浸蜡的操作过程，提高了鱼鳃组织石蜡制备固定和组织浸蜡的效果，提高了鱼鳃组织石蜡切片制备时的切片问题，极大地提高了鱼鳃组织切片的结构清晰度，解决了现有技术在鱼鳃组织制作过程中存在的若干问题。利于免疫细胞化学染色的抗原定位，因而在鱼鳃组织切片上进行原位杂交、免疫组织化学及免疫荧光等实验可以显示某些基因和蛋白的组织分布和细胞定位，为进一步从细胞、基因和蛋白水平上进行鱼鳃研究提供了切实可行的条件。

主权项

鱼鳃组织石蜡切片的制作方法，包括步骤如下：（1） 固定 将鱼鳃组织剪成3 mm×3 mm×2 mm 的小块浸泡于Bouin’s 溶液中进行固定，室温条件下固定24 h，期间换Bouin’s 溶液2~3 次；（2）脱钙 将（1）处理的材料流水冲洗24 h，然后浸入Perenyi’s 脱钙液中，室温条件下保持5 d ；（3）脱水 将（2）处理后的材料依次浸入上行梯度乙醇脱水，步骤依次是：60% 乙醇浸泡0.5 h，70% 乙醇浸泡0.5 h，80% 乙醇浸泡0.5 h，90% 乙醇浸泡1 h，95% 乙醇浸泡1 h，95% 乙醇浸泡2 h，无水乙醇浸泡40 min，无水乙醇浸泡40 min ；(4) 透明 将（3）处理好材料依次浸入二甲苯浸泡15 min、二甲苯浸泡15 min ；（5）石蜡渗透 将经（4）处理好材料浸入二甲苯与石蜡按体积比1:1 的溶液中浸泡30min，然后转移到56℃的石蜡中渗透4 h ；（6）包埋 将牛皮纸折成小纸盒，先将加温溶解的石蜡倒入纸盒中，然后迅速将经（5）处理好材料切面朝下、鳃瓣与切面平行摆放在纸盒中，冷却成型；(7) 切片 将（6）包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成连续的蜡带，蜡带形状为长方形，上下两个长边平行，切片厚度为5~6μm ；（8）展片和黏片 将（7）切好的蜡带分割呈适宜的片段，放在50~55℃的蒸馏水面，观察到切片充分扩展时，迅速用涂有黏片液的载玻片将切片捞取，将切片控制在载玻片的最佳观察位置，将玻片放在40℃的恒温箱烤片12 h，烤干后的切片贴上标签或记号，放到玻片收藏盒内；（9）脱蜡复水 将(8) 处理后切片脱蜡，依次浸泡在二甲苯两次，每次均为5 min，然后进行下行梯度乙醇复水，依次浸泡在无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95% 乙醇3 min、70%乙醇5 min，然后用清水冲洗5 min、蒸馏水冲洗1 min ；（10）染色 将经过（9）处理的切片放入苏木精中染色15 min，用自来水冲洗1s 后，放入体积百分比为1% 的盐酸乙醇溶液中分化退色1s ；（11）复染 将（10）处理的切片放入自来水流水中漂洗10 min、蒸馏水冲洗1s 后，经过伊红乙醇溶液复染1 min，然后蒸馏水漂洗1‑5 s ；最后经过75% 乙醇荡洗1‑5 s、95% 乙醇冲洗1 min、无水乙醇冲洗1 min、无水乙醇冲洗1 min、二甲苯冲洗3 min、二甲苯冲洗3 min ；（12）封固 在经（11）处理的切片上滴2‑3 滴的加拿大树脂后，迅速将盖玻片小心盖上，不能产生气泡，若有气泡要挤压出来，然后将封片在室温下自然干燥即可。