克氏原螯虾眼柄多肽激素的提取方法

摘要

本发明公开了一种克氏原螯虾眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步骤：1.眼柄分离将眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7％NaCl的Tris-HCl缓冲液中解剖出视上神经节(包含窦腺)，每1mL缓冲液放入50个视上神经节。2.超声波破碎超声波输出功率为150-300W，超声处理温度45-65℃，超声处理时间为工作5s-间隔5s，循环30次。3.受热粗分离上清液在80-85℃下水浴5min并离心，重复热水浴两次。4.反相高效液相色谱先经过Sep-Pak小柱，再经过反相高效液相色谱柱，柱温40℃；流动相为乙腈-甲醇-0.6％乙酸(体积比为5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脱；收集时间为洗脱开始的2-65min，检测波长280nm。本发明用避免低温的超声破碎结合反相高效液相色谱，提取效率高，纯度好，提取的眼柄多肽激素混合液可以用于实验室功能研究。

主权项

一种克氏原螯虾眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步骤：(1)眼柄分离选取健康活性好的克氏原螯虾，不分性别，保持体表清洁，将其眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7％NaCl的Tris‑HCl缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中解剖出视上神经节(包含窦腺)，在体视显微镜下剥离去除结缔组织后置于1.5mL的离心管中，每1mL缓冲液放入50个视上神经节。(2)超声波破碎将步骤(1)的缓冲液搅拌均匀，静置，放置于超声波细胞粉碎仪中，超声波输出功率为150W‑300W，超声处理温度45℃‑65℃，超声处理时间为工作5s‑间隔5s，循环30次。将破碎后的匀浆液离心15min(4℃，12000rpm)，取上清液。(3)受热粗分离将步骤(2)中上清液在80℃‑85℃下水浴5min，使其中的非耐热蛋白受热变性而沉淀下来。所得上清液再次离心，重复热水浴两次。得到的上清液即为河蟹视上神经节内多肽激素的粗提液。(4)反相高效液相色谱将步骤(3)的粗提液经过Sep‑Pak小柱，收集后合并其馏分作为供试液经过反相高效液相色谱柱。色谱条件为：色谱柱L Bondapak C18，ID 4mm*250mm，10μm；预柱为ID 4mm*30mm；柱温40℃；流动相为乙腈‑甲醇‑0.6％乙酸(体积比为5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脱；收集时间为洗脱开始的2‑65min，检测波长280nm。收集流出组分即为克氏原螯虾眼柄多肽激素的混合提取物。