一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法

摘要

一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法，它涉及一种自杀质粒及其构建方法。敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成。构建方法：一、扩增片段prcKL；二、得到质粒pUC18-KL；三、扩增片段prcKR；四、得到质粒pUC18-KLKR；五、扩增四环素抗性基因Tet；六、得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。本发明用于生物工程研究领域。

主权项

一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT，其特征在于敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT按以下步骤构建：一、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因左侧片段prcKL，扩增片段prcKL的上游引物为prcKL‑up，prcKL‑up的核苷酸序列为5’‑CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG‑3’，扩增片段prcKL的下游引物为prcKL‑down，prcKL‑down的核苷酸序列为5’‑GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT‑3’，PCR扩增片段prcKL的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL‑up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL‑down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKL的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、62℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；二、用限制性内切酶Sac I及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcKL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKL双酶切片段、5μl质粒pUC18双酶切片段、2.5μl 10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18‑KL；三、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因右侧片段prcKR，扩增片段prcKR的上游引物为prcKR‑up，prcKR‑up的核苷酸序列为5’‑GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG‑3’，扩增片段prcKR的下游引物为prcKR‑down，prcKR‑down的核苷酸序列为5’‑CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT‑3’，PCR扩增片段prcKR的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR‑up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR‑down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKR的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；四、用限制性内切酶Pst I及Kpn I对质粒pUC18‑KL和步骤三获得的片段prcKR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKR双酶切片段、5μl质粒pUC18‑KL双酶切片段、2.5μl 10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18‑KLKR；五、以pBR322质粒为模板PCR扩增四环素抗性基因Tet，扩增Tet的上游引物为Tet‑up，Tet‑up的核苷酸序列为5’‑CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT‑3’，扩增Tet的下游引物为Tet‑down，Tet‑down的核苷酸序列为5’‑GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT‑3’，PCR扩增Tet的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的pBR322质粒、10μL浓度为1pmol/μL的Tet‑up、10μL浓度为1pmol/μL的Tet‑down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增Tet的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、46℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；六、用限制性内切酶Kpn I对质粒pUC18‑KLKR和步骤五获得的四环素抗性基因Tet分别进行酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl四环素抗性基因Tet酶切片段、5μl质粒pUC18‑KLKR酶切片段、2.5μl 10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，即得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。